بررسی وجود DNA با استفاده از اسپکتوفوتومتری:
بررسی وجود DNA با استفاده از اسپکتوفوتومتری:
به منظور ارزيابي كميت و كيفيت DNA و آگاهي از ميزان غلظت و خلوص آن مي توان از روش اسپكتروفتومتري استفاده كرد. در اين روش ساده و دقيق ، ميزان جذب اشعه UV توسط بازهاي DNA اندازه گرفته مي شود.مولكول هاي DNA به علت حضور بازهاي آروماتيك آدنين، تيمين، سيتوزين و گوانين داراي جذب نوري زياد در محدودة ماوراء بنفش مي باشند. بنابراين اندازه گيري جذب نوري محلول هاي DNA شاخص خوبي براي درجه خلوص آن مي باشد.
حداكثر جذب مولكول DNAدر طول موج 260nm است. از طرفي معمولاً محلول هاي DNA مقداري آلودگي پروتئيني دارند كه حداكثر جذب محلول هاي پروتئيني نيز به علت حضور اسيدهاي آروماتيك مانند تريپتوفان فنيل، تيروزين و آلانين در طول موج 280nm ميباشد. بنابراين نسبت جذب در طول موج ها 260/280 را مشخص مي کنند. جذب نوري معيار مناسبي براي تعيين نسبت Protein/DNA در يك نمونه و به عبارتي درجه خلوص خواهد بود. به همين علت جهت تعيين غلظت DNA محلول ، بايد جذب آن را در طول موج هاي 260nm و 280مشخص نمود.
براي تعين كميت: مي توان از فرمول زير استفاده نمود.
dsDNA(mg/ml)= OD260×50×Dilution Factor
1000
بنابراين هر واحدOD260، يعني1 A=تقريباً معادل با 50 ميكروگرم در ميلي ليتر DNA دو رشته اي است.
براي تعيين كيفيت: ميزان خالص بودن DNA را مي توان از نسبت دو جذب به صورت زير محاسبه نمود:
جذب در280nm/ جذب در 260nm= نسبت جذب(A)
8/1¬ A< غلظت پروتئين بالا است
8/1¬ A> غلظت RNA بالا است
جهت انجام اين كار از دستگاه اسپكتروفتومتر استفاده مي شود. ابتدا محلول DNA را به نسبت 1 به20 رقيق ميكنيم. جهت بلانك ( Blank ) كردن دستگاه مقدار μl100 محلول TE مورد استفاده قرار مي گيرد. سپس ميزان جذب نوري در طول موج 260 و 280 خوانده مي شود و نسبت اين جذب ( 280/260 ) در هر مورد محاسبه مي گردد كه براي تمامي DNA هاي مورد بررسي بين 7/1 الي 2 مي باشد. غلظت DNA نيز توسط دستگاه محاسبه ميشود كه بين 5/0 الي μl/μg 2 بود .
سوالات:
غلظت DNA استخراج شده چقد راست؟
1/8 ایده آل است.
غلظت DNA=50 x OD260 x akse reghat
به منظور اندازه گیری میزان آلودگی نمونه به ترکیبات آلی مثل تیوسیانات و فنلات از چه طول موجی استفاده میشود؟230
DNA خالص؟ 1