بیوفیلم

چکیده:

بیوفیلم نوعی پوشش لزجی در روی سطح های جامد است که بوسیله ی رشد باکتریها در طبیعت پدید می آید. یک گونه یا بیشتر از باکتری‌ها بیوفیلم  را می سازند. به بیوفیلم­ها یی که با یک گونه باکتری به وجود می آید monoculture   نامیده شده است، ولی بیوفیلم‌های تشکیل شده بر روی سطح های مخاطی مـثل روده ،  که بیشترآمیزه ای  از گونه های گوناگونی از باکتری­ها می باشند را multicultur گویند. بیوفیلم نوعی لجن باکتریایی است که در هر جایی که آب موجود باشد، رشد می کند.99 درصد تمام باکتری ها در درون بیوفیلم زندگی می کنند. باکتری ها اجتماع  خودرا در در درون یک لایه­ لزج محافظت کننده می سازند.بااین کار می توانند مواد غذایی را که یک باکتری  به تنهایی قادر به هضم و تجزیه آن ها نیست، را قابل مصرف کنند. بیوفیلم به گروهی از سلول هایی گفته می شود که روی یک سطح تثبیت شده و همگی بوسیله یک ماتریکس از مواد پلیمری آلی، با منشاء میکروبی (اگزوپلیمر گسترده گلیکوکالیکس) احاطه شده اند. این اگزوپلی ساکاریدها که بیش از 90 درصد وزن خشک بیوفیلم را تشکیل می دهند؛ باعث تسهیل اتصال به سطح های، تشکیل میکروکلونی و مقاومت به مواد ضد میکروبی می شود.

پیش گفتار

      بیوفیلم توده ای از باکتریها را در بر می گیرد که بر روی یک  سطح جامد  به یکدیگر می چسبند ،و بر روی هم اثر متقابل  دارند. پیرامون آن ها را ماتریکس خارجی از جنس پلی ساکاریدی احاطه می کند(2). توانایی باکتریها برای چسبیدن به سطح ها، به ویژه در ارگانیسم‌های پاتوژن ،  یک پدیده مهم  برای آغاز بیماری  بشمار می آید(1).

      در طبیعت، باکتری ها بیشتربه صورت کلونی در گروه های درهم ، رشد می کنند و به ندرت به صورت جداگانه و یا کشت خالص یافت می شوند. بیوفیلم های مخاطی و پلاک های دندانی(شکل1-1)، نمونه های شناخته شده این پدیده در انسان هستند(10). همچنین در طبیعت ماده لغزنده موجود بر روی سنگ های رودخانه(شکل1-2) و پوشش نازک ژل مانند بر دیواره داخلی گلدان که گل ها به مدت نزدیک به یک هفته در آن نگهداری شده اند، نیز نمونه هایی از بیوفیلم هستند(3). تشکیل بیوفیلم یک استراتژی جهت پایدارماندن باکتری ها است. دراین راستا  ازمواد غذایی استفاده ی بهینه می شود.

 کلیات

      بیوفیلم ها اجتماعاتی از باکتری ها، جانوران و گیاهان میکروسکوپی می باشند که به یک سطح می چسبند  و  یک لایه ژله ای می سازند. این لایه افزون بر فراهم نمودن محیط مناسب برای زیستن ، به بهترچسبیدن و پایدارماندن میکروب ها بر روی سطح ها کمک می کند و نقش محافظتی نیز دارد. در محیط­های آبی، سلول­های میکروبی به مواد جامد مانند مواد معدنی و فلزات موجود در محیط می چسبند و واکنش های معدنی شدن را آغاز می نمایند. سلول های تثبیت شده رشد می کنند و پلی­مرهای خارج سلولی که بیشتر به شکل یک ماتریکس درهم از جنس فیبربل می باشند، را تولید می کنند(9).

   میکروارگانیسم­های درون بیوفیلم، توانایی  حفظ محیط سطحی و درونی بیوفیلم در برابر عوامل گوناگون مانند  pH، اکسیژن محلول و دیگر عوامل آلی و معدنی می باشند. چنین پیدا است که میکروارگانیسم­ها درون بیوفیلم مواد معدنی را تولید می کنند و  واکنش های جانشینی این مواد را به گونه ای انجام می دهند که با فرضیات ترمودینامیکی بر پایه واکنش های شیمیایی قابل پیش گویی نمی باشد. بیشتر بیوفیلم ها حاوی سلول های ارگانیسم ها وفرآوردهای آن­ها (پلیمر های خارج سلولی) هستند(9).

 در بیشتر نمونه ها ، در بیوفیلم هایی که در محیط های آبی تشکیل می­شوند، مقدار چشمگیری از مواد و ذرات معدنی مانند خاک رس، جذب می شود و در این ساختار به دام می­افتند. رویهمرفته  بیوفیلم­ها ساختار چند  گونه ای[1]  دارند؛ به این معنی که حاوی ساختارهای بسیار پیچیده با فضاهای خالی، مجراها، حفرها، منفذها و رشته ها می باشند ، که در این ساختار یاخته ها دارای آرایش خوشه ای و یا به صورت میکروکلونی­هایی هستند که توسط حفرهایی ازهم مجزا میشوند. ساختارهای پیچیده ی گونه های وسیع  بیوفیلم ها را چنین گزارش کرده اند:

-         بیوفیلم های متانوژنیک در راکتورهای  Fixed – bed

-         بیوفیلم های هوازی تشکیل شده در گیاهان موجود در آب های آلوده

-         بیوفیلم های تثبیت کننده ازت

-         بیوفیلم های کشت خالص ویبریو پاراهمولیتیکوس و سودوموناس ائروژینوزا

حفرهای درونی در رساندن مواد غذایی به لایه های زیرین بیوفیلم نقش مهمی را انجام  می دهند. بیوفیلم در سطح های مرطوب گاه به صورت پوشش پیوسته و گاه به صورت تکه تکه ساخته  می شود(9).

      توسعه و گسترش بیوفیلم­ها بر روی هر نوع سطحی که میکروارگانیسم­ها وجود دارند، امکان پذیر است. بیوفیلم ها در همه ی محیط های آبی دیده می شوند. نقش اتصال باکتری ها در شرایط گوناگون بررسی شده است . تشکیل بیوفیلم یک فرایند پویایی است و شامل مراحل متعددی می باشد.  ساخت  بیوفیلم در هر سطحی که اندرون محیط  باکتری باشد، انجام پذیر است(4).

    در میان  فرآورده های ی  غذایی، باکتری ها همراه با دیگر ملکول های آلی و غیر آلی همانند  پروتئین های گوشت و شیر ، با جذب درسطح ها، شرایط ایجاد بیوفیلم را فراهم می کنند. این ملکول های آلی و غیر آلی و میکروارگانیسم ها از راه  انتشار و یا جریان متلاطم مایع برروی سطوح  جایگزین می­شوند. دراین میان سرعت جابجایی  و میزان جذب این اجزاء بر روی سطح ها از اهمیت یکسانی برخوردار است(4).

انتقال مواد مغذی در فاز مایع بسیار سریع ­تر از باکتری ها در بیوفیلم ها می­باشد. این افزایش در میزان مواد غذایی، امکان ایجاد بیوفیلم را افزایش می­دهد و از سویی به محیط رقابتی نیزبستگی دارد که در تشکیل بیوفیلم شرکت می کند(11).

      میکروارگانیسم های  یکسان یا متفاوت ،مانند باکتری ها، جلبک ها، آمیب ها و پروتوزوئرها، گرایش به رها شدن از محیط و ورود  به توده ی بیوفیلمی دارند. در یک توده ی بیوفیلمی رسیده ، جمعیت میکروبی دهنده های الکترونی را اکسید نموده ، باعث کاهش گیرنده های الکترونی می شوند و پتانسیل احیاء را کاهش می دهند(9).

      هر اندازه که لایه بیوفیلمی کلفت تر باشد، عمقی که یک پذیرنده الکترونی در طول لایه باید طی کند، با پذیرنده الکترونی دیگر تداخل پیدا می کند. بنابراین در یک محیط طبیعی، توده ی میکروبی که از گونه­های مختلف ساخته  شده باشند ، موفق ترخواهند بود. لایه بیوفیلمی که در محیط آبی سرشار از اکسیژن باشد ، فعالیت­های اتوتروفیکی و هتروتروفیکی هوازی در آن انجام می گیرد و باعث  کاهش دسترسی به الکترون درعمق بیوفیلم می شود. نیترات یک گیرنده الکترونی است  که توسط جمعیت میکروبی خاص ، مانند دنیتریفایرهای اجباری استفاده می شود.  باکتری­های سولفات نیز از سولفات به عنوان گیرنده الکترون استفاده می کنند(9).

خاصیت های بیوفیلم

      بیوفیلم ها و توده های میکروبی خاصیت های فیزیکوشیمیایی دارند که برای کارکرد آن­ها در طبیعت، ارزش     سرنوشت سازی دارند. این ویژه گی ها عبارتند از:

-         پایداربودن نسبت به اصطکاک

-         پایداری مکانیکی بیوفیلم ها  و توده ها          

-         پایداری هیدرولیتیکی بیوفیلم در غشاءهای جدا کننده

-         مقاومت به هدایت گرمایی در نوسان های دما

-         مقاومت انتشاری ماتریکس بیوفیلم در راکتورهای بیوفیلمی

-         گنجایش جذب سطحی، به ویژه سازوکاربیوفیلم ها در جذب سطحی بیولوژیکی

-         خاصیت پیوند با ملکول های آب

-         معماری ماتریکس و پیچیدگی ساختار پلی ساکاریدها و آنزیم­های خارج سلولی(6).

یکی از ترکیب های مهم که در ایجاد خواص فیزیکی و فیزیکو شیمیایی بیوفیلم ها نقش مهمی دارد ، ماتریکس اگزوپلی ساکاریدی می باشد(6).

 میکروارگانیسم های موجود در بیوفیلم

      گرچه میکروارگانیسم­های سازنده ی بیوفیلم، زندگی پلانکتونی نیز دارند، اما   بیو­شیمی این میکروارگانیسم­ها متفاوت است. بررسی های گذشته نشان داده است  که این تغییر و تفاوت ،  به علت  خاموش شدن یک دسته  و پویا شدن دسته ی دیگراز ژن ها می باشد. به عنوان مثال سودوموناس ائروژینوزا در حالت زندگی بیوفیلمی به سنتز آلژینات نیاز دارد. بنابراین ژن­های سنتز کننده آلژینات پویا می‌گردند. بررسی ها نشان می­دهد که رونویسی از ژن alga  که محصول آن آلژینات می باشد، در زندگی بیوفیلمی چهار برابر بیش از حالت پلاکتونی انجام  می­گیرد(9).

      باکتری ها، مقدار کمی از ملکول هایی به نام مواد علائم دهنده حسی نظیر اسیل هوموسرین لاکتون را به طور پیوسته، ترشح می کنند. همزمان که شمار این باکتری ها افزایش می یابد، غلظت مواد علائم دهنده، زیاد می شود. هنگامی که اندازه ی این مواد به آستانه غلظت رسید، باکتری ها پاسخ داده و رفتار خود را با تغییر فعالیت ژن ها، تغییر می دهند. این حالت در گونه های مختلف باکتری ها، متفاوت است. سودوموناس ائروژینوزا، آلژینات تولید می کند. ژن هایی ممکن است فعال شوند که بر روی مسیرهای متابولیکی و تولید عوامل بیماری زایی اثر می گذارند(2).                                                                                                

     پژوهش های مرکز  CBC در سال 2000 میلادی نشان داد که میکروارگانیسم­ها ی موجود در بیوفیلم نسبت به گونه های آزاد آن­ها (میکروارگانیسم­هایی با زندگی پلانکتونی­) به ترکیبات ضد میکروبی مقاوم ترند. این بررسی ها نشان می­دهد که بیش از 40 –­30 درصد   پروتئین های موجود در دیواره سلولی باکتری ها و میکروب ها بین حالت پلانکتونی و بیوفیلمی متفاوت می باشند. این تغییر پروتئینی باعث تغییر جایگاه های هدف آنتی بیوتیکی بر روی این میکروارگانیسم­ها می شود، بنابراین مکانیسم مرگ و پاسخ آن­ها به آنتی بیوتیک­ها متفاوت می­شود. در بررسی های این مرکز در سال 2001 میلادی فاکتور سیگمایی شناسایی شده است که نوعی سیگنال باکتریایی جهت تغییر بیوشیمی زندگی بیوفیلمی را نشان می دهد. این مرکز اعلام کرده است که اگر بتوان فاکتور معکوس سیگما را کشف نمود، می توان بیوفیلم­ها را به سلول­های مجزا و پلانکتونی تبدیل کرد. به این ترتیب می توان اثرات مخرب بیوفیلم­ها را در محیط کاهش داد(9).

واکنش های دوسویه ی میکروبی

      اثرهای متقابل میکروب های گوناگون در یک بیوفیلم نقش مهمی در ساختار و فیزیولوژی بیوفیلم ساخته شده را دارد. در بیوفیلم های میکروبی، اثرهای متقابل میکروبی گوناگونی دیده می شود که اغلب بسیار پیچیده می باشد و گاهی چندین نوع اثر در یک بیوفیلم پدید می آید. این واکنش ها در بین گونه­های باکتری دیده می شود. گاهی نیزدر یک بیوفیلم یک گونه باکتری که در آغاز در ساخت بیوفیلم شرکت می کند، شرایط را برای  ورود باکتری های خاصی (که سازگار با باکتری های تشکیل دهنده بیوفیلم باشند) به بیوفیلم تسهیل و از ورود و تجمع دیگر گونه های باکتری جلوگیری می نماید. دربررسی ها روشن شده است که بیوفیلم­هایی که از انباشت  چندین گونه باکتری ساخته  می­شوند، بسیار ضخیم­تر و مستحکم­تر از بیوفیلم­هایی هستند که تنها از تجمع یک نوع باکتری تشکیل شده اند. برای نمونه ، در پژوهشی که در درازای یکسال بر روی یک راکتور اتمی انجام گرفت، ضخامت بیوفیلم حاصله از دو باکتری سودوموناس ائروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه به ترتیب 30 و 15 میکرومتر بود در حالی که  بیوفیلم بدست آمده  از آمیختن هر دو نوع باکتری، ضخامتی در حدود 40 میکرومتر داشت(12).

      امروزه روشن شده است که اگزوپلی­ساکارید بیرونی ، نقش بسزایی در کلونیزه شدن انواع میکروارگانیسم­ها در سطح های گوناگون دارد. گمان می­رود که در بیوفیلم ساخته شده از گونه های گوناگون باکتری ها، اگزوپلی­ساکارید برآمده از یک گونه منجر به افزایش مقاومت سایر گونه­ها و یا تقویت استقرار آن­ها در بیوفیلم می شود. همچنین بیوفیلم بدست آمده در واکنش های دوسویه ی  پلیمرهای مختلف ترشح شده در داخل یک بیوفیلم، بسیاراستوارتر خواهد بود(13).

چشم انداز بیوفیلم ها

    بیوفیلم­ها درعرصه ی پزشکی، صنایع غذایی، سیستم های تصفیه آب و صنعت نفت می توانند مشکل آفرین باشند.ییوفیلم هایی که بر روی بدنه کشتی­ها ایجاد می شوند، از دیاتومه ها، جلبکهای تک سلولی و باکتری­ها ساخته  شده اند. این بیوفیلم ها حرکت کشتی را کند و مصرف سوخت را افزایش می دهند. تشکیل کلنی میکروبی، همچنین کارآیی پریسکوپ­ها و وسایل زیردریایی را پایین می­آورد، شبکه های آب­رسانی هم مستعد تشکیل بیوفیلم هستند و بیوفیلم به­وجود آمده حتی با مقادیر بالای کلر هم ازبین نمی روندد. در سیستم های تصفیه،  گاهی ضخامت بیوفیلم ها به بیش از۵۰۰ میکرو متر می‌رسد و در نتیجه نفوذ پذیری غشاء­ها به میزان زیادی کاهش می یابد(1).

4-3- اثرات زیانبار ناشی از تشكیل بیوفیلم

1- كاهش ضریب انتقال حرارت در مبدل های حرارتی و كندانسورها

2- گرفتگی خلل و فرج مخازن نفتی در مراحل ازدیاد برداشت

3- چسبیدن میكروارگانیسم ها بر روی بدنه كشتی به ضخامت ۱۰ میكرون که باعث افزایش مصرف سوخت شناور از ۳/۰ درصد تا یك درصد می­گردد. ضخامت های زیاد گاهی تا ۵۰ درصد، مقدار مصرف سوخت را افزایش می دهند.

4- تشكیل بیوفیلم با ضخامت ۱۰۰۰ میكرون در لوله هایی به قطر ۵/۱۲ میلی متر، سبب كاهش سرعت جریان به میزان ۵۰ درصد می گردد.

5- مقاومت به بیوسایدها یا زیست کش ها(14).  

6- ایجاد خوردگی(5)

7- تجزیه و تخریب پوشش های آلی از جمله رنگ ها و پوشش های اپوكسی(5)

 

 

مزایای تشکیل بیوفیلم

      فعاليت هاى صنعتى و كشاورزى باعث آزاد شدن فلزات سنگين و سمى در محيط  مى­شوند. اين فلزات حيات اكوسيستم­ها و سلامتى انسان را به مخاطره مى­اندازند. باكترى‌ها می‌توانند كاتاليزكننده حالت سمى فلزات به حالت هاى غيرسمى يا كاهش تحرك آن­ها باشند. مانند احياى مستقيم CrIV (سمى و محلول) به CrIII (كمتر سمى و نامحلول)، اكسيداسيون MnII، انتقال فعال جيوه به خارج سلول توسط اپران .mer زيست درمانى به معنى استفاده از اين موجودات در پاكسازى محيط از آلودگى هاست. مى توان سويه هاى باكترى مهندسى شده اى ايجاد كرد كه توانايى زيادى در تجمع يون هاى فلزى داشته باشند. تلاش هايى كه در اين راستا انجام شده شامل بيان بالاى پپتيدها يا پروتئين هايى نظير پلى هيستيدين ها يا متالوتيونين ها است كه به فلزات سمی و محلول متصل مى شوند و فلزات را از چرخه طبیعت جدا می سازند(8).

حذف فلزات به­وسیله میکروارگانیسم های پساب

      پلی مرهای خارج سلولی میکروارگانیسم­هایی که در لجن فعال وجود دارد، گرایش زیادی به فلزات دارند. زوگله آرامیگرا و باسیلوس لیکنی فورمیس که از لجن فعال جدا می شوند، پلی مرهایی تولید می‌کنند که می توانند  با آهن، مس، کادمیوم، نیکل یا اورانیوم (که محلول و سمی هستند)کمپلکس ایجاد کرده، آن‌ها را متراکم کنند و فلزات انباشته شده  به ­وسیله اسید هیدروکلریک از بیوماس جدا می شوند. زوگله آرامیگرا می تواند تا 17 درصد مس را از هر گرم بیوماس جدا کند، و زمانی­که در دانه های آلژینات تثبیت شود، می توان از محلول­هایی با غلظت 250 میلی گرم در لیتر کادمیوم، این فلز را خارج کند(قابل ذکر است که دانه های آلژینات هم تا حدودی کادمیوم را جذب می کنند). برخی میکروارگانیسم­ها نیز سیدروفورهایی می سازند که آهن را محلول کرده، آن را به داخل سلول وارد می کنند(1).

  سیستم های غیر زنده میکروبی تثبیت شده مانند باکتریها، قارچ ها و جلبک ها را نیز می توان برای حذف فلزها ی  پساب به­کار برد. به عنوان مثال، فرآورده ای به ­نام Algasorb که حاوی سلول­های جلبک به­دام افتاده در ژل سیلیکون است، می تواند اورانیوم را جذب کند. همچنین میسلیوم  قارچ هایی مانند آسپرژیلوس و پنی سیلیوم نیز برای حذف فلزات از پساب به ­کار می روند. فلزات با صرف انرژی و سرعت کمتری  به سطح  یا به درون قارچ ها جذب می شوند. در این باره  می­توان به جذب کادمیوم به مقدار زیاد توسط آسپرژیلوس اوریزه­آ اشاره کرد. جذب کادمیوم به­صورت فعال به بیوماس قارچ ناچیز می باشد، بنابراین می توان گفت که جذب فلزات بوسیله قارچ ها به فرآیندهای متابولیکی آن­ها وابستگی ندارد(1).

 بازسازی خاک با استفاده از بیوفیلم ها

* باسیلوس سوبتیلیس را در خاک با بذر مدفون می کنند که  بعد از تشکیل بیوفیلم در خاک، تولید Bulbiformis می کند.
* سفالوسپوریوم گرامینئوم را با کاه در خاک چال  می کنند که  پس از تشکیل توده بیوفیلمی[2] در خاک، تولید ماده ضد قارچی می کند.
* پنی سیلیوم راکفوتی را با بذر در خاک چال  می کنند که  پس  از تشکیل بیوفیلم در خاک، تولید Rockfotia می کند.

* انواع استرپتومایسس ها را در ریزوسفر ذرت دفن می کنند که پس  از مدتی با تشکیل بیوفیلم، تولید ماده ضد قارچی می کند و از ریزوسفر ذرت حفاظت می کند.

* جهت حل شدن فسفات ها در خاک، باکتری هایی همچون اروینیا و بولخوردریا را به خاک اضافه می‌کنند که این باکتری­ها، در جهت حل فسفات موجود در خاک، تشکیل  بیوفیلم می دهند.
 * جهت پاکسازی محیط[3] و مبارزه با قارچ ها و باکتری های بیماری زا از سودوموناس، کوماموناس، بولخوردریا و زالزتومیا استفاده می کنند(8).

 

ازهم گسستن بیوفیلم ها

      با افزایش سن یک بیوفیلم، باکتری­های چسیبده برای تنازع بقاء و ایجاد کلونی­های تازه  باید ازبیوفیلم جدا و رها شوند. بدین روی  سلول های دختر به تنهایی و یا توده ای از بیوفیلم جدا می­شوند(4). در فرم توده ای، عمل جدا شدن به صورت پریودیک رخ می دهد و در هر زمان تکه ی بزرگی از سلول­های باکتری ها از بیوفیلم  خارج می­شوند. علت این پدیده ممکن است؛ تغییر سرعت جریان مواد شیمیایی موجود در مایع و یا تغییر خواص باکتری های موجود در بیوفیلم  باشد. باکتری‌های رها شده می‌توانند به نقطه تازه ای منتقل شده و فرآیند تشکیل بیوفیلم را آغاز کنند(11).

کنترل و ازمیان بردن بیوفیلم

بهترین روش کنترل بیوفیلم پیشگیری از گسترش آن­هاست. اقدام های  بهداشتی و پاکسازی موثرترین راه است.در این باره ،ترکیبی از روش­های شیمیایی و فیزیکی که بتواند از انباشت مانده­های فرآورده های غذایی و سلول‌های باکتریها بر سطح دستگاه ها جلوگیری کند.کارساز خواهد بود. پاکسازی توسط برس زدن، ساییدن و خراش دادن سطح ها ضروری است، زیرا یک سلول باکتریایی رها شده از یک بیوفیلم، مقاومت کمتری به مواد بهداشتی دارد(7).

هدف پاکسازی، شکستن پیوندهای  EPSدر لایه سطحی می باشد. پاک کننده های اسیدی جهت روفتن  خاک معدنی و با موادی نظیر زنگ به کار می روند. استفاده از آب  ولرم جهت افزایش کارایی پاک کننده های شمیایی مطلوب است. استفاده از آب با دمای 80 درجه فارنهایت پروتئین ها را بر روی تجهیزات لخته می نماید و امکان ایجاد بیوفیلم را فراهم  می­کند(7).

کلرین، یدوفور و ترکیبات آمونیوم چهار ظرفیتی در ازبین بردن بیوفیلم موثر نیستند. پراکسید و مواد بهداشتی حاوی پراکسید به شدت در حذف بیوفیلم موثرند. سرعت واکنش آن­ها بسیار شدید است (2–1دقیقه) و اثر خورندگی سطح را نیز ندارند(7).

 

منابع:

1-       امتیازی،گیتی،میکروبیولوژی و کنترل آلودگی آب، هوا و پساب­­­­ ،انتشارات مانی،1379.

2-        نوروزی، جمیله، کلیات باکتری شناسی پزشکی، انتشارات جعفری، 1387، صفحه311-309.

3-        Biofilm, Key to understanding and controlling bacterial growth in Automated Drinking Water Systems, Edstrom Industries, Inc.(800)-558-5913

4-        Characklis, W.G., 1981. Fouling biofilm development: A process analysis. Biotechnol. Bioeng. 23, 1923-1960.   

5-        Carballo L, Arajjo AB. Influence of surface characteristics of food contact materials on bacterial attachment. Biomicro world. Int Conference of Biofilms in Spain. 2005. 

6-        Debeer,D., Stoodley, P., Lewandowski, Z., 1997. Measurement of local diffusion coefficients in biofilms by microinjection and confocal microscopy. Biotechnol. Bioeng. 53, 151-158.      

7-        Deibel, Virginia. Biofilms, Brain Wave Technologies, Inc., Internet Journal of Food Safety V.1, 6-7.   

8-        Gudbjornsdottir B, Suihko ML, Gustavsson P, Thorkelsson G, Salo S, Sjoberg AM, et al, Effect of Bacterial Biofilm on Corrosion and biocorrosion, Corrosion Science Section Journal, March 2008.

9-        Hodgson, A.E., Nelson, S.M., Brown,M.R.W., Gilbert, P., 1995. Asimple in vitro model for growth control of bacterial biofilms. Bacteriol.79,87-93.    

10-    Jean Barbeau, Carl Gauthier, and Pierre Payment. Biofilms, infectious agents, and dental unit waterlines: a review, Can. J. Microbiol. Vol. 44, 1998.

11-    Jeong, D.K., Frank,J.F., 1994. Growth of Listeria monocytogenes at 218 in biofilms with microorganisms isolated from meat and dairy environments, Technol.27, 415-246.    

12-    Siebel, M.A., Characklis, W.G., 1991. Observation of binary population biofilms. Biotechnol.Bioeng.37, 778-789.

13-    Sutherland, I.W., 1983. Microbial exopolysaccharides- their role in microbial biofilms. Antimicrob. Agents.40, 2517-2522.     

14-    Trachoo N. Biofilms and the food industry. J Sci Technol. 2003; 25(6): 807-15.