عنوان آزمایش: شناسایی باکتری ها بر اساس واکنش های شیمیایی

هدف:

شناسایی باکتری ها بر اساس واکنش های شیمیایی

مقدمه:

محیط کشت Triple Sugar Iron Agar  (TSI)

از این محیط دارای مشخصات خاصی هستند به طوری که محیط TSI قرمز رنگ و دارای سه قند گلوکز ,لاکتوز و سوکروز می باشد که به صورت دو قسمت عمقی (Butt ) و شیب دار (Slant ) تهیه می شود و جهت تشخیص قابلیت باکتری ها در استفاده از لین سه قند و تخمیر آنها (همراه با ایجاد گاز CO2 و یا بدون تولید آن ) و از طرفی تولید گاز H2S به کار می رود..تخمیر قندها به واسطه تولید اسید و زرد رنگ شدن محیط TSI مشخص می شود به طوری که اگر باکتری فقط قادر به تخمیر گلوکز باشد فقط قسمت عمقی و هم قسمت شیب دار زرد رنگ می شود.از طرفی تولید گاز CO2 به واسطه ایجاد حباب یا ترک خوردگی در محیط کشت یا بالا فرستادن محیط کشت مشخص می شود.

محیط SIM محیطی است نیمه جامد و زرد کم رنگ که به واسطه آن سه آزمایش تولیدH2S تولید اندول و حرکت باکتری ها مورد بررسی قرار می گیرد. این محیط فقط دارای عمق است و به صورت Stab کشت داده می شود.

تولید اندول به وسیله اضافه کردن چند قطره معرف کوآکس برسطح محیط SIM و تغییر رنگ معرف به صورتی تا بنفش نمایان می شود.حرکت باکتری نیز که در تشخیص انواع باکتری از آن استفاده می شود به واسطه وجود کدورت در اطراف محل ورود آنس در این محیط پس از ۲۴ ساعت مشخص می گردد.بررسی تولید H2S در محیط SIM آهن پپتونه است که مناسب تر از معرف سولفات آهن موجود در TSI است.

اسیدی شدن را با حرف A و قلیایی شدن را با Alk نشان می دهیم.

A/A:تمام لوله زرد است و باکتری تمام قند را مصرف کرده و سبب اسیدی شدن محیط شده است.

Alk/A:این حالت در طی 72 ساعت نشان دهنده مصرف تنها گلوگز است و بقیه قند ها مصرف نشده اند.

Alk/Alk :هیچ قندی مصرف نشده و محیط تغییر رنگ نمی دهد و شرایط قلیایی است.

اگر باکتری در این محیط قادر به استفاده از تیو سولفات سدیم باشد H2S  تولید می کندکه با املاح آهن موجود در محیط رسوب سیاه رنگ خواهد داد. همچنین اگر تخمیر قندبا تولید CO2 همراه باشد,حباب و ترک خوردن و حتی جابجایی محیط را خواهیم داشت.

 

 

محیط  کشت سیمون سیترات (S.C )

محیط سیمون سیترات (S.C ) نیز محیطی است سبز رنگ و شیب دار که حاوی سیترات می باشد که اگر باکتری دارای آنزیم سیتراتازیا سیترات لیاز باشد با مصرف و تبدیل آن به کربنات سدیم رنگ محیط را از سبز به آبی تغییر می دهد.

تست سیترات: برخی از باکتریها قادر هستند تا سیترات را به عنوان منبع غذائی مصرف و تولید اسید نمایند.

محیط کشت: سیمون سیترات آگار یا سیمون سیترات براث (سبز)

نتیجه گیری: ایجاد رنگ آبی در لوله نشان دهنده ی مثبت بودن تست و عدم تغییر رنگ مؤید منفی بودن آن ا

 

محیط  کشت Oxidative / Fermentative ( O/F)

با کشت باکتری در این محیط می توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت کرفته است .این محیط را در دو قسمت ،یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه نموده و از نمونه در هر دو محیط کشت می دهیم.در صورتی که باکتری تنها از طریق اکسیداسیون قند را مورد استفاده قرار دهد،تنها در لوله ی فاقد پارافین قند را مصرف کرده و محیط را اسیدی نموده،که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در می آید.رنگ زرد ازبالای لوله شروع می شودکه باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید،هر دو لوله ی کشت ( حاوی پارافین و فاقد پارافین ) بر اثر تولید اسید شاهد ظهور رنگ زرد خواهیم بود. از محیط OF می توان در تمایز کوکسی های گرم مثبت بخصوص استافیلوکوک اورئوس استفاده نمود .

 

روش آزمایش:

ابتدا میز کار ار با الکل ضدعفونی کرده.باکتری های مورد نظر را درکنار شعله بر روی محیط های TSIو S.C کشت خطی داده.برای محیط O/Fکشت ساده داده. به مدت 24 ساعت انکوبه کرده.

مشاهدات:

روش TSI	محیط اولیه	محیط ثانویه(بعد از رشد)
رنگ محیط کشت در Staphylococcus aureus	قرمز	زرد
تولید گاز CO2 در Staphylococcus aureus		ترک خوردگی در قسمت بالای  محیط کشت

 

روش TSI	محیط اولیه	محیط ثانویه(بعد از رشد)
رنگ محیط کشت در E.coli	قرمز	زرد
تولید گاز CO2 در E.coli		بالا فرستادن محیط کشت

 

 

 

 

 

 

 

روش O/F	محیط اولیه	محیط ثانویه(بعد از رشد)
رنگ محیط کشت در E.coli  بدون پارافین	آبی	محیط کشت اولیه خراب بوده نتیجه ای مشاهده نشد
تولید گاز CO2 در E.coli  با پارافین	آبی	محیط کشت اولیه خراب بوده نتیجه ای مشاهده نشد

 

 

 

روش S.C	محیط اولیه	محیط ثانویه(بعد از رشد)
رنگ محیط کشت در E.coli	سبز یشمی	باید  كشت شيب دار  Slant  Cultures بود تا در عمق رشد کند. روی سطح آبی
Klebsiella	سبز یشمی	باید  كشت شيب دار  Slant  Cultures بود تا در عمق رشد کند. روی سطح آبی

 

MRVP	رشد
Enterobacter	+
Klebsiella	+

 

عنوان آزمایش: سنجش حساسیت باکتری ها به آنتی بیوتیک

v\:* {behavior:url(#default#VML);} o\:* {behavior:url(#default#VML);} w\:* {behavior:url(#default#VML);} .shape {behavior:url(#default#VML);}
هدف: سنجش حساسیت باکتری ها به آنتی بیوتیک تاریخچه: مدتها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود بطور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ - ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونتها بکار می‌بردند. اولين شكل آنتي بيوز باكتريها در سال 1877 بوسيله پاستور و ژوبر نشان داده شد. اين دانشمندان مشاهده كردند كه بعضي از باكتريها مانند شاربن وقتي با بعضي ديگر از باكتريهاي ساپروفيت مانند باسيل سوبتليس مخلوط شود رشد آنها بكندي صورت مي گيرد . ابتدا خيال مي كردند كه باسيل سوبتليس اكسيژن محيط را گرفته و مانع تنفس باسيل شاربن مي گردد. ولي چندين سال بعد در سال 1880 پاستور باكتريهای پاستورلامولتوسیدا را پيدا كرد و نشان داد اگر صاف شده كشت پاستورلامولتوسيدا در مجاورت باسيل سوبتليس و پيوسيانيك قرار بگيرد رشد نخواهد كرد. صاف شده اين باسيل ها نيز از رشد پاستورلا مولتوسيدا جلوگيري ميكرد. بالاخره پاستور در يادداشت هاي خود مي نويسد كه اين ترشحات در آينده ممكن است براي درمان بيماريها مورد استفاده قرار بگيرد . در سال 1885 بابس (Babes) مشاهده كرد كه بعضي از ميكروبهاي هوازي ساپروفيت موادي ترشح مي نمايند كه باكتريهاي بيماريزا را مي كشد. در سال 1896 رو (Roux) پني سليوم را براي از بين بردن باسيل حصبه و كلي باسيل بكار برد. در سال 1899 امرليش لو از باسيل پيوسيانيك ماده اي استخراج كرد بنام پيوسياناز كه در درمان بيماري سياه زخم و عفونت هاي چرك زا بكار رفته است. ولي در حقيقت مطالعه درباره ي آنتي بيوتيك ها از سال 1929 شروع شد . فلمينگ موقعي كه كلني هاي استافيلوكوك بيماري زا را روي ژلوز كشت مي داده متوجه شد كه استافيلوكوكها گاهي توسط قارچ هايي احاطه مي شود، اين قارچ ها مانع رشد استافيلوكوك مي گردند. اين قارچ ها را پني سليوم نوتاتوم نام گذاري كرد. فلمينگ عصاره اين قارچ را تهيه نمود و براي جدا كردن بعضي از باكتريها مانند هموفيلوس آنفلوانزا بكار برد. ولي بعد ها به فكر افتاد كه آنرا در درمان عفونت ها بكار برد. در سال 1939 چين و فلوري با ساير همكاران آكسفورد خود كشت خالص پني سيلين را تهيه نمود و آنرا به حالت كريستاليزه بدست آورد و خواص درماني آنرا نشان داد.پس از تهيه پني سيلين عده اي محققين از قارچ ها و آكتينوميست ها موادي بتدريج استخراج كردند كه مي توانست در درمان بيماريها مورد استفاده قرار بگيرد. بموازات اين بررسي ها تحقيقات در زمينه خواص ضد ميكروبي بعضي از مواد شيميايي آغاز گرديد. در سال 1903 ارليش نشان داد كه بعضي از مواد شيميايي مانند رنگهاي آزرونيك خاصيت ضد ميكروبي دارد ، ولي براي سلول هاي بدن سمي نمي باشد. به دنبال اين زمينه، مطالعات محققين در روي مواد شيميايي ضد ميكروبي شروع شد.       آنتی بیوتیک ها : آنتی بیوتیک ها ترکیباتی هستند که توسط میکروارگانیسم ها تولید و سبب کشتن یا مهار رشد سایر میکروارگانسیم ها میشوند. بسیاری از آنتی بیوتیک ها نیز به صورت مصنوعی سنتز میشوند مانند آنتی بیوتیک مترونیدازول . اولین بار آنتی بیوتیکی به نام 606 که ترکیبی از رنگ های آرسنیکی و سالوارسان بود در درمان تریپانوماپالیدم ، عامل سفلیس به کار برده شد. سپس الکساندر فلمینگ از کپک پنیسیلیوم نوناتوم ، پنی سیلین را استخراج کرد که یکی از مهمترین کشف ها در این زمینه میباشد. چگونگی اثر آنتی بیوتیک ها:        الف) باکتریواستاتیک (Bacteriostatic)         ب) باکتریوسیدال (Bacteriocidal) آنتی بیوتیک های باکتریو استاتیک این آنتی بیوتیک ها باعث مهار رشد باکتری میشود . اثرات این دسته آنتی بیوتیک ها بستگی به قدرت سیستم ایمنی دارد پس اینگونه آنتی بیوتیک ها در افراد دارای نقص سیستم ایمنی مورد استفاده قرار نمی گیرد.  منحنی باکتریوسایدی می تواند در امتداد زمان با توجه به غلظت های مختلف آنتی بیوتیک تغییر کند آنتی بیوتیک های باکتریوسیدال  این آنتی بیوتیک ها موجب کشته شدن باکتری ها می شود. زنده ماندن باکتری ها در پدیده باکتریوساید تصادفی است.تفاوت ژنتیکی بین آنها وجود ندارد.  طیف فعالیت: آنتی بیوتیک هایی با طیف اثر محدود Narrow  آنتی بیوتیک هایی که روی تعداد معدودی باکتری موثر هستند مثل پنی سیلین ها که بیشتربر روی باکتری های گرام مثبت موثر هستند.  آنتی بیوتیک‌های با طیف محدود، آنهایی هستند که فقط در مقابل یک میکرو ارگانیسم یا طیف بسیار محدودی از میکروارگانیسم‌ها فعّال می‌باشند؛ مانند وانکومایسین که عمدتاً در مقابل کوکسی‌های گرم مثبت مانند استافیلوکوک‌ها و انتروکوک‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند. آنتی بیوتیک هایی با طیف اثرگسترده Broad آنتی نیوتیک های موثر بر طیف گسترده از باکتری ها مانند تتراسیکلین و کلرامفینیکل. MIC: حداقل غلظتی ار آنتی بیوتیک که از رشد باکتری ممانعت میکند. MBC : حداقل غلظتی از آنتی بیوتیک که میکروارگانیسم را میکشد .  آنتی بیوتیک‌های وسیع الطّیف، آنهایی هستند که در مقابل انواع مختلف میکرو ارگانیسم‌ها فعّال می‌باشند. مانند تتراسایکلین که در مقابل بسیاری از باکتری‌های گرم منفی، کلامیدیا، مایکوپلاسما و ریکتزیا‌ها موثّر است. (MIC 50): برابر است با غلظتی از آنتی بیوتیک که مانع رشد 50 درصد از باکتری ها گردد ( نمودار 4-12)    دقیق ترین و با ارزش ترین غلظت است.    حساسیت جمعیت متوسط تحت تاثیر inoclume قرار نمی گیرد و افزایش inoclume باعث افزایش هتروژنسیته باکتری می گردد. MIC 90 برابر است با غلظتی از آنتی بیوتیک که مانع رشد 90 درصد باکتری می شود که با CMA برابر است MIC 99  برابر است با غلظتی از آنتی بیوتیک که مانع رشد 99 درصد باکتری می شود   تقسیم بندی آنتی بیوتیک ها بر اساس عملکرد : 1.موثر بر سنتز دیواره سلولی(مهار سنتز دیواره) این دسته تماما باکتریوساید هستند   2.مهار کننده سنتز پروتئین بسته به نوع پروتئین میتوانند باکتریوساید یا استاتیک باشند 3.موثر بر غشا سیتوپلاسمی این دسته تماما باکتریوساید هستند 4.موثر بر اسید نوکلئیک این دسته تماما باکتریوساید هستند 5.آنتی متابولیت ها بسته به نوع مسیر متابولیکی که غیر فعال میشود میتوانند باکتریوساید یا استاتیک باشند.   آنتی بیوتیکها و عوامل ضد میکروبی: واژه آنتی بیوتیک در اصل به موادی اشاره می کند که منشاء زیستی دارند درحالیکه واژه عوامل کموتراپیک.(شیمی درمانی)  به مواد شیمیایی سنتزی اشاره دارد. تفاوت قائل شدن برای این دو واژه در حال محوشدن است،چون بسیاری از آنتی بیوتیکهای جدید در واقع محصولات زیستی هستند که به روش شیمیایی دچار تغییر شده اند و یا حتی محصولات زیستی می باشند که به شکل شیمیایی سنتز شده اند.       استاندارد هاله عدم رشد و تفسیرMIC   آنتی بیوتیک ( مقدار به ازای هر دیسک و باکتری) قطر هاله عدم رشد                      MIC تقریبی  (micro gm/ml) R I MS S R S Ampicillin (10 micro gm)               Enterobacteriaceae 12-13   >14   >32 Staphylococcus spp.     >29   beta-Lactamase Haemophilus spp.     >20   >4 Enterococci   >17     >16   Other streptococci   22-29 >30   >4 Chloramphenicol (30 micro gm) 13-17   >18   >25 Erythromycin (15 micro gm) 14-17   >18   >8 Nalidixic acid (30 micro gm) 14-18   >19   >32 Streptomycin (10 micro gm 12-14   >15       Tetracycline (30 micro gm) 15-18   >19   >16 Trimethoprim (5 micro gm) 11-15   >16   >16       یک آنتی بیوتیک خوب باید دارای خصوصیات زیر باشد: 1-دارای خاصيت سمیت انتخابی (selective toxicity) باشد. یعنی فقط روی عامل بیماری زا اثر کند و به سلول ميزبان آسيب نرساند .اينحالت نسبي است يعني غلظتي از دارو كه سلول ميزبان مي تواند تحمل كند به ميكروارگانيسم عفوني آسيب مي رساند . 2-طیف وسیعی داشته باشد و روی تعداد زیادی از باکتری ها اثر بگذارد. 3-اثر باکتریسیدال آن از خاصیت باکتریواستاتیکش بیشتر باشد 4-در آب به خوبی محلول و پایدار باشد و نیاز به کاربرد با دوزهای بالا نداشته باشد. 5-عوارض آن کم، قیمت آن مناسب و با حداقل دوز مؤثر واقع شود. سنجش حساسیت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک: 1-تهیه رقت در لوله 2- تهیه رقت در آگار 3- استفاده از دیسک روش آزمایش: رقیق کردن در محیط مایع Staphylococcus aureus نام باکتری محیط براث   شماره لوله 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 غلظت آنتی بیوتیک 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 5/0 25/0     محیط براث 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc 1cc رقت 1cc آنتی بیوتیک ورتکس 1cc از لوله شمار1-ورتکس 1cc از لوله شمار2-ورتکس 1cc از لوله شمار3 -ورتکس 1cc از لوله شمار4-ورتکس 1cc از لوله شمار5-ورتکس 1cc از لوله شمار6-ورتکس 1cc از لوله شمار 7-ورتکس 1cc از لوله شمار8-ورتکس 1cc از لوله شمار9-ورتکس 1cc از لوله شمار 10-ورتکس 1cc از لوله شماره 11 1cc آنتی بیوتیک   باکتری 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc 0/1 cc   1cc     در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 تا 48 ساعت قرار می دهیم. رشد             MIC + + + + +   +       تفسیر: رشدی انجام نشود: Mic=MBC رشد انجام شود:Micبزرگتر از MBC کشت از لوله های قبل: بدون رشد= MBC

عنوان آزمایش: اثر عوامل فیزیکی و شیمیایی بر رشد میکروارگانیسم ها

عنوان آزمایش: اثر عوامل فیزیکی و شیمیایی بر رشد میکروارگانیسم ها

هدف:

مشاهده اثر PHو فشار اسمزی بر رشد  Staphylococcus aureusو E.coli  

مقدمه:

 دامنه: باکتری‌ها

 فرمانرو: یوباکتریا

 شاخه: فیرمیکوت‌ها

 رده: باسیل‌ها

راسته: باسیلالس

 تیره: استافیلوکوکاسیه

 سرده: استافیلوکوک

 گونه: استافیلوکوک اورئوس

 نام علمی Staphylococcus aureus

 

دامنه: باکتری

 شاخه: پروتئوباکتریا

 رده: گاما پروتئوباکتریا

راسته: انتروباکتریال‌ها

 تیره: انتروباکتریاسه

 سرده: اشریشیا

 گونه E. coli نام علمی Escherichia coli

اثر عوامل فیزیکی و شیمیایی بر رشد میکروارگانیسم ها:

همه میکروارگانیسمها از جمله باکتریها تحت تاثیر عوامل محیطی قرار دارند. عوامل محیطی بر رشد ، تکثیر و مرگ باکتریها تاثیر می‌گذارند. بعضی از باکتریها حرارت بالا و برخی حرارت پایین را دوست دارند. تغییرات PH یعنی تغییر غلظت یون هیدروژن در محیط زندگی باکتریها ، بر روند زندگی باکتریها موثر است. بطور کلی هر باکتری خواهان یکسری شرایط اپتیمم برای زندگانی است که در صورت عدم تامین آن شرایط ، زیست آن با مشکل مواجه شده و به زودی از بین خواهد رفت.

فشار اسمزی :

Asmotic pressure

نیرویی است که وقتی بین 2 محلول از طریق غشایی تراوا ، حلال که عموما آب است ، از محلولی به محلول دیگر انتقال یابد. به آن wa یا water availability  نیز می گویند. wa فشار اسمزی است که به طور کمی آن را با a_w  یا  water activity  بیان می کنند.

مایعات ایزوتونیک ٬ هیپوتونیک و هیپرتونیک(isotonic, hypotonic, hypertonic fluids):

اگر سلول را در محلولی از ماده غیر نافذ با اسمولاریته ی 282 mOsm/lit قرار دهیم ٬ سلول ها نه چروکیده می شوند و نه متورم زیرا غلظت آب در مایعات داخل و خارج سلول برابر است و مواد حل شدنی نمی توانند به سلول وارد یا از آن خارج شوند. به چنین محلولی ایزوتونیک(isotonic) می گویند زیرا نه باعث تورم سلول ها می شود نه سبب چروکیدگی آنها. محلول 0.9 درصد کلرید سدیم و محلول 5 درصد گلوکز نمونه هایی از محلول های ایزوتونیک هستند. این محلول ها در طب بالینی مهم هستند زیرا می توان آنها را به درون خون تزریق کرد بدون آنکه تعادل اسمزی بین مایعات داخل و خارج سلول را به هم بزنند.

اگر سلول را در محلولی هیپوتونیک(hypotonic) قرار دهیم که غلظت مواد غیر نافذ آن کمتر از 282 mOsm/lit باشد آب به درون سلول منتشر خواهد شد و آن را متورم خواهد کرد ٬ آب پیوسته به درون سلول منتشر می شود و ضمن رقیق سازی مایع داخل سلولی ٬ مایع خارج سلولی را غلیظ خواهد کرد ؛ این اتفاق تا زمانی ادامه می یابد که اسمولاریته در محلول تقریبا برابر شود. محلول های کلرید سدیم با غلظت کمتر از 0.9 درصد هیپوتونیک هستند و سلول را متورم می سازند.

اگر سلول را در محلولی هیپرتونیک(hypertonic) که غلظت مواد غیر نافذ آن بیشتر است قرار دهیم ٬ آب از سلول وارد مایع خارج سلولی خواهد شد و ضمن تغلیظ مایع داخل سلولی ٬ مایع خارج سلولی را رقیق خواهد کرد. در این مورد سلول چروکیده خواهد شد تا این که غلظت دو طرف برابر شود. محلول های کلرید سدیم با غلظت بیشتر از 0.9 درصد هیپرتونیک هستند.

تراکم یون هیدروژن :

PH ارتباط مستقیمی با مقدار یون H  در محلولها دارد. بیانگر مقدار غلظت یون در محلولهاست. مقدار غلظت یون H که افزایش یابد به سمت اسیدی و وقتی کاهش یابد به سمت بازی تغییر می کند.

میکروارگانیسم ها pH های مختلفی دارند که این محدوده رشد را pH Growth Range  می نامند. 

باکتریها در محیط های کشت، ترکیباتی را تولید می کنند که می تواند pH را تغییر دهد و این تغییرات را با اندیکاتورهایی که در محیط های کشت وجود دارد مثل : فنل رد ، نوترال رد ، بریلین گرین شناسایی می کنند.

 

رشد باکتریها و فعالیت آنها به شدت تحت تاثیر PH قرار دارد. ولی بین نیازمندیهای انواع گونه‌ها و PH اختلاف زیادی وجود دارد. هر گونه فقط در حد معینی از PH می‌تواند رشد کند و سریع ترین رشد در ناحیه محدودی از PH انجام می‌شود.

  PH  :

هر موجود زنده در یک محدوده معینی از PHرشد می کند و یک PH مطلوب دارد . باکتری ها در مقایسه با قارچ ها مقاومت کمتری به PH زیاد دارند . برخی باکتری ها ی اسید دوست می توانند در PH پایین برخی مواد اسیدی رشد کنند مثل گونه های لاکتوباسیلوس که در اسید لاکتیک رشد می کنند ، استوباکترزیلینوم در اسیداستیک و تیوباسیلوس تیواکسیداز در اسید سولفوریک رشد می کنند .

بیشتر قارچ ها یک PH حداقل بین 1.5 تا 2.0 برای رشد دارند ، اما برخی گونه های Demiataceae , Acontium Velatim  گزارش شده  که درغلظت 2.5 N اسید سولفوریک اشباع با cuso₄ رشد می کند .

بازوفیل ها : باکتری هایی که درPH بالای 10.5 رشد می کنند . بیشتر بازوفیل هایی که در گذشته شناسایی شده اند آرکوباکتری ها هستند . باکتری ویبریوکلرا که عامل بیماری وبا می باشد در PH نسبتا بالا رشد می کنند . میکروارگانیسم ها در محیط هایی که PH بالا دارند سعی می کنند که با صرف انرژی PH را نزدیک محدوده خنثی نگه دارند . موجودات زنده برای مقاومت در برابر PH خارج دارای یک ساختمان خارجی هستند که از آنها حفاظت می کنند .

 

روش آزمایش:

محیط های کشت با pH های مختلف 3 ، 5، 7، 9 را در اختیار داریم و همچنین میکرو ارگانیسم Staphylococcus aureus و E.coli  را مورد بررسی قرار می دهیم . هر گروه یکی از میکرو ارگانیسم ها را در یکی از محیط های کشت نوترینت براث ، کشت می دهد و به مدت 24 ساعت برای E.coli  و Staphylococcus aureus را در دمای 37 درجه سانتیگراد  در انکوباتور قرار می دهیم . در پایان نتایج را براساس رشد (+) و عدم رشد و کدورت (-) گزارش می کنیم .  در می یابیم که کدام باکتری محدوده pH بیشتری را تحمل می مند و کدام یک افزایش Ph  باعث جلوگیری رشد آن می گردد. و اینکه کدام اسید دوست و کدام قلیا دوست یا نوتروفیل اند. در نتیجه جدول زیر را تهیه کردیم:

 

نام باکتری	3	5	7	9
Staphylococcus aureus	-	-	-	+
E.coli	-	-	-	+

 

محیط های کشت با میزان نمک های مختلف 5/0 %، 5 % ، 7% و 10 % را در اختیار داریم و همچنین میکرو ارگانیسم E.coli  و Staphylococcus aureus را مورد بررسی قرار می دهیم . هر گروه یکی از میکرو ارگانیسم ها را در یکی از محیط های کشت نوترینت براث، کشت می دهد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار می دهیم . در پایان نتایج را براساس رشد (+) و عدم رشد و کدورت (-) گزارش می کنیم .  در می یابیم که کدام باکتری محدوده رشد نمکی آن بیشتر بوده و با افزایش فشار اسمزی کدامیک توان رشد را از دست داده. اینکه کدام حساس و کدام مقاوم بوده است. در نتیجه جدول زیر را تهیه کردیم:

نام باکتری	5%	10%	5/0%	7%
Staphylococcus aureus	+	-	-	-
E.coli	-	-	+	-

تفسیر:

نام باکتری	دامنه PH
Staphylococcus aureus	4-6
E.coli	5/3-7/8

 

نام باکتری	دامنه Nacl
Staphylococcus aureus	5-6 درصد
E.coli	1-2 درصد

 

 

عنوان آزمایش: شمارش باکتری ها

عنوان آزمایش: شمارش باکتری ها

هدف:

روش شمارش باکتری های زنده

مقدمه:

شمارش باکتری‌ها

در آزمایش‌های میکروبی باید بتوانیم تعداد باکتری‌ها را بشماریم. این شمارش می‌تواند در یک‌سان‌سازی دوز مصرفی باکتری یا مقایسه و سنجش اثر یک ماده بر شمار باکتری‌ها به کار برده شود. روش‌های گوناگونی برای شمارش باکتری‌ها به کار می‌رود که به هدف شمارش، امکانات موجود و مایع یا جامد بودن کشت باکتری بستگی دارد.

روش تهیه‌ی رقت:

ابتدایی‌ترین روش شمارش باکتری‌ها کشت دادن حجم خاصی از سوسپانسیون آن‌ها روی محیط کشت می‌باشد. در این روش حجم خاصی از سوسپانسیون باکتری روی محیط کشت جامد کشت داده می‌شود و پس از سپری‌شدن زمان لازم برای رشد باکتری، تعداد کلنی‌ها شمارش می‌شود (اگر این حجم خیلی کم باشد دقت کار پایین می‌آید). هر کلنی به توده‌ای از باکتری‌ها گفته می‌شود که در نتیجه‌ی رشد یک عدد باکتری اولیه روی محیط جامد ایجاد شده است.

بنابراین پس از رشد، می‌توان تعداد کلنی‌ها را برابر با تعداد باکتری‌ها در سوسپانسیون اولیه در نظر گرفت. ایراد این روش، فراگیر نبودن آن می‌باشد. زیرا در صورتی که تعداد باکتری‌ها خیلی زیاد باشد، آن‌ها تمام سطح پلیت را می‌پوشانند و تفکیک و شمارش تعداد کلنی‌ها ممکن نیست. از طرفی برخی میکروب‌ها ممکن است روی محیط جامد قابل کشت نباشند. اما با این حال هنوز این روش در بسیاری موارد کاربردی و مفید است.

شمارش کلونی ها:

دو روش برای شمارش کلونی ها وجود دارد:

الف) دستگاه کلونی کانتر که به طور اتوماتیک تعداد کلونی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.

ب) روش دستی که پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دارد و با علامت گذاری خانه ها تعداد را بدست می آوردند.

 روش محاسبه:

الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد)← جهت شمارش پلیت هایی انتخاب شوند که بین 30 تا 300 کلونی داشته باشند که برابر میانگین تعداد کلونی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته.

ب) محاسبه تخمینی← اگر در تمام رقت ها بیش از 300 کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلونی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلونی گزارش می کنند.

کشت در پلیت : به سه روش قابل انجام است .

1-        کشت خطی

2-        کشت سطحی

3-        کشت آمیخته یا پورپلیت

کشت سطحی :

در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود.

نحوه کشت :

این روش کشت بیشتر برای محیطهای مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیسمهای موجود در آن را مشخص نمود.

برای اینکار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه نمائید. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانید کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنید توجه داشته باشید که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .

چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یک گرمخانه با دمای 50-25 درجه قرار داده و خشک نمود.به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهید تا قطرات رطوبت حذف گردد.

همچنین می توانید پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائید. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

کشت آمیخته  یا پورپلیت :

در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد . یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آنرا در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده بمیزان 15-20 سی سی به پلیت اضافه نمائی. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آنرا کاملا مخلوط کنید. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیز کشت بپوشانید دراینحالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

برای انجام این آزمایش به ابزار زیر نیازمندیم:

پلیت ، لوله آزمایش ، پیپت 2و5سی سی ، سرم فیزیولوژی ، محیط کشت نوترینت آگار، دستگاه کلونی کانتر ، انکوباتور ، سوسپانسیون باکتری E.coli

شرح آزمایش:

8 عدد لوله‌ی آزمایش دربسته حاوی 9 میلی‌لیتر سرم فیژیولوژی ریخته را استریل کنید. لوله‌ها را از 1 تا 8 شماره‌گذاری کنید و به ترتیب درون جا لوله‌ای قرار دهید.
از نمونه‌ی اولیه سوسپانسیون باکتری E.coli که می‌خواهید باکتری‌های آن را بشمارید یک میلی‌لیتر در شرایط استریل (کنار شعله یا زیر هود) به لوله‌ی شماره‌ی 1 منتقل کنید.
محتوای لوله‌ی اول را خوب مخلوط کنید تا رقت ^1-10 شما کاملاً یک نواخت گردد. سپس  1 میلی‌لیتر از آن را در شرایط استریل به لوله‌ی بعدی منتقل کنید.
مرحله‌ی قبل را به ترتیب برای لوله‌های بعدی تکرار کنید تا رقت ^8-10 به دست آید.از آخرین لوله 1cc را بیرون ریخته تا تمام لوله آزمایش ها 9cc باشند. در شکل زیر همین روند را مشاهده می‌کنید. هر چه رنگ کم‌رنگ‌تر می‌شود نشان‌دهنده‌ی رقیق‌تر شدن سوسپانسیون اولیه است.

 

حال که رقت ها را تهیه کردیم ، نوبت به کشت آنها می رسد. برای هر رقت یک پلیت استریل مشخص می کنیم. از هر لوله مقدار 0/1ml  برداشته و به داخل پلیت های مربوط به آن رقت می ریزیم .

روش پور پلیت:

پس از این کار حدودا  15 cc  از محیط نوترینت آگار  را در هر پلیت می ریزیم ( البته به علت کمبود محیط کشت مقداری کمتر از 15 cc در هر پلیت ریختیم ). دمای محیط کشت نباید زیاد باشد تا میکروارگانیسم ها کشته شوند ؛ تقریبا حدود 45 تا 50 درجه سانتیگراد.

پلیت ها را 5 مرتبه به شکل 8 حرکت می دهیم تا محلول یکنواخت شود. سپس آنها را بی حرکت می گذاریم تا بسته شود.

پلیت ها را باید علامت گذاری کنیم که شامل رقت ، گروه ، ساعت و روز کلاس می شود.

پلیت ها را در انکوباتور 32 درجه به مدت 48 ساعت قرار دادیم. بعد از رشد کلونی ها نوبت به شمارش آنها می رسد. برای دقت در کار بهتر است که تمام پلیت ها را شمارش کنیم.

روش سطحی:

پلیت نوترینت آگار را برداشته از هر رقت 0/1ml برداشته و به محیط اضافه میکنیم و با میله سرکج آن را کاملا ماساژ می دهیم.

پلیت ها را در انکوباتور 32 درجه به مدت 48 ساعت قرار دادیم. بعد از رشد کلونی ها نوبت به شمارش آنها می رسد. برای دقت در کار بهتر است که تمام پلیت ها را شمارش کنیم.

پلیت ها را روی دستگاه کلونی کانتر گذاشته با ماژیک روی کلونی ها علامت گذاشته و می شماریم

 

نتایج:

روش کشت خطی:

1-2-3= بیش از 300 کلونی

4=296 کلونی

5=225 کلونی

6=89 کلونی

7=9 کلونی

8=6 کلونی

296+225+89=610  

3= 203/3÷ 610 میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

10^-4 + 10^-5+ 10^-6)=   )÷NCFU=203/3

 10⁺⁴×1/831

روش پورپلیت:

1= بیش از 300 کلونی

3=275 کلونی

4=100 کلونی

5=25 کلونی

6=7 کلونی

7=2 کلونی

8=1 کلونی

275+100=375

2=187/5÷375  میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

10 ^-3 +10^-4)=  )÷NCFU=187/5

10⁺³×17/045

 

 

 

 

رنگ آمیزی دانه های درون سیتوپلاسمی

هدف:

رنگ آمیزی دانه های درون سیتوپلاسمی

مقدمه:

انکلوژن ها (در فارسی: انکلوزیون(Inclusion bodies دانه های ذخیره ای در باکتری ها هستند که بسته به نوع باکتری انواع مختلف آن را تولید می کنند.
مهمترین این دانه های عبارت اند از :
1- دانه های متاکروماتیک
2- دانه های چربی
3- دانه های گوگردی

در داخل سیتوپلاسم میکروارگانیسم ها اجسامی هستند به نام Inclusion body که نقشهای مختلفی دارند همانند نمونه های زیر:

Lipid granule: معمولا یوکاریوتها و پروکاریوتها برخی دانه های چربی را در سیتوپلاسم خود ذخیره می کنند ، زمانی که محیطهای کشت خوبی در اختیار باکتریها یا مخمر قرار می گیرد که شرایط خوب تغذیه ای هم فراهم شود ، باکتری یا مخمر این دانه ها را در زمان خاصی مورد استفاده قرار می دهد . برخی باکتریها که اسپور دارند مثل باسیلوس و کلستریدیوم از این منابع چربی برای مرحله اسپوروژن به عنوان منبع انرژی مورد استفاده قرار می دهند. دانه های پربی به روش سودان سیاه به عنوان رنگ اصلی و سافرنین به عنوان رنگ فرعی رنگ آمیزی می شود. دانه های چربی به صورت سیاه رنگ در زمینه قرمز قابل مشاهده اند.

Glycogen granule: معمولا برای مشاهده دانه های گلیکوژن از ید یا لوگل استفاده می شود.

Sulphur granule: دانه های گوگردی معمولا در باکتری های فتوسنتتیک گوگردی مشاهده می شوند. نیازی به رنگ آمیزی برای مشاهده شدن ندارند فقط کافی است این باکتریها را جداسازی کرده و مشاهده کنیم.

Metachromatic granule: در باکتریهای کورینه باکتریوم وجود دارد و پلی مری از متافسفات می باشد. رنگ آمیزی آلبرت در این موارد استفاده می شود. دانها آبی رنگ دیده می شوند در مرکز باکتری.

PHB granule: پلی متاهیدروکسی بوتیرات ، نوعی اسید چرب است، در برخی باکتری ها نظیر ازتوباکترها و برخی باسیلوس ها موجودند. معمولا این دانه در زیر گروه PHA(پلی متاهیدروکسی آلکانوئات) قرار می گیرند.

Carboxysomes granule: این دانه ها در تثبیت دی اکسید کربن نقش دارند.

Cyanophycin granule: ترکیباتی غنی از پلی پپتید و اسید آمینه آرژنین و آسپارتیک اسید هستند و به عنوان منابع ذخیره نیتروژن برای باکتریها محسوب می شوند. معمولا کربوکسی زوم ها و سیانوفیسین ها در سیانو باکترها و برخی باکتریها نظیر رودوباکتر و رودواسپریلیوم دیده می شوند.

Magnetasomes granule: خاصیت مغناطیسی دارند و از اکسید آهن Fe₃O₄ تشکیل شده اند. مگنتوزوم ها در طول نصف النهار مغناطیسی زمین قرار می گیرند و تعیین کننده نصف النهار مغناطیسی می باشند، با مطالعه این باکتریها می توان تغییرات نصف النهار مغناطیسی را در طول عمر کره زمین بررسی کرد.

 

 رنگ آمزی آلبرت :

نوعی رنگ آمیزی اختصاصی است.تجمعی از پلی فسفاتهاي غیرآلی (Volutin granules) دانه هاي متاکروماتیک (گرانولهاي ولوتین هستندکه پس از رنگ آمیزي با یک رنگ بازي مانند متیلن بلو و یا تولوئیدین بلو به رنگ سیاه دیده می شوند. این روش براي مشاهدة دانه هاي متاکروماتیک در جنس کورینه باکتریوم و تعدادي دیگر از انواع باکتریها کاربرد دارد.

 

باکتری مورد آزمایش:

 اشریشیا کُلای که به «ای کُلای» یا کُلای باسیل نیز معروف است، یک باکتری گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه که در سال ۱۸۵۵ کشف شد. این باکتری بیهوازی اختیاری و بدون اسپور می‌باشد. باکتری های اشیرشیا کلای، اغلب متحرک می‌باشند. کلای باسیل قادر به تخمیر گلوکز وتولید گاز است وهمچنین لاکتوز راتخمیر می‌کند و اوره‌آز منفی است.باکتری اشریشیا کولای که در روده جانداران خونگرم (منجمله انسان) زندگی می‌کند؛ از گلوکز تغذیه می‌کند و در غیاب گلوکز از لاکتوز هم به عنوان منبع انرژی استفاده می‌کند. بعنوان مثال، وقتی یک محصول لبنی می‌خوریم، دی ساکارید لاکتوز در دسترس باکتری ای کُلای قرار می‌گیرد. در این هنگام با ساختن آنزیم‌های لازم که برای جذب و تجزیه لاکتوز هستند از این قند به عنوان منبع انرژی استفاده می‌شود.

مواد و وسایل:

اشرشیاکلای-لوگل-سافرانین-آب مقطر-لام-شعله

 

روش آزمایش:

-1گسترش اشرشیاکلی را تهیه کنید.

-2 گسترش را مدت2 دقیقه تحت تأثیر محلول لوگل قرار دهید.

-3 با آب مقطر آن را بشوئید.

-4 لام را مدت  30ثانیه تحت تأثیر محلول سافرانین قرار دهید.

5- با آب مقطر آن را بشوئید.

6-زیر میکروسکوپ ابتدا با عدسی40 بعد با عدسی100مشاهده نمائید.

 

مشاهدات:

در این روش باکتری به رنگ قرمز مایل به صورتی  دیده می شود.و دانه های کربوهیدرات در آن تیره تر است.

 

.

مشاهده ی اجزاء ساختمان سلول باکتری به وسیله ی رنگ آمیزی مرکب چین

هدف:

مشاهده ی اجزاء ساختمان سلول باکتری به وسیله ی رنگ آمیزی مرکب چین

مقدمه:

*مکانیسم رنگ آمیزی:

یک ماده رنگی یک ترکیب آلی است که از یک حلقه بنزنی و دو ریشه کروموژن و اگزوکروم  تشکیل شده است. ریشه اگزوکروم باعث می شود وقتی ماده رنگی در شرایط محلول و آب قرار می گیرد یونیزه و باردار شود. اگر ماده رنگی بار منفی پیدا کند اسیدی است مثل ماده رنگی ائوزین و اگر ماده رنگی بار مثبت پیدا کند باز است مانند متیل بلو. در باکتری ها یکسری از مواد سلولی اسیدی و یکسری بازی اند. مواد سلولی اسیدی بار منفی دارند و با رنگ های بازی رنگ می گیرند و مواد سلولی بازی بار مثبت دارند و با رنگ های اسیدی رنگ آمیزی می شوند.

بطور کلی رنگ آمیزی باکتری ها به دو عامل فیزیکی و شیمیایی آنها بستگی دارد.

1-      عوامل فیزیکی

الف: ماده ای که رنگ می گیرد باید تا حدودی نفوذپزیر باشد. نفوذ رنگ ها به درون این مواد به علت وجود فشار اسمزی و خاصیت مویینگی است.

ب: در برخی از روش های رنگ آمیزی جذب رنگ صورت می گیرد. به این ترتیب که مولکول های رنگ آمیزی قادر می باشند بطور بانتخابی ه درون فضاهای مولکولی یک ماده رفته و در آنجا باقی بماند.

ج: چسبندگی نیز در برخی از روش ها، مکانیسم رنگ آمیزی می باشد که رنگ در غلظت های زیاد و به سطح ماده رنگ شونده می چسبد.

 

2-      عوامل شیمیایی

الف: سلول های میکروبی، پروتئین ها دارای ترکیبات شیمیایی هستند که برخی حالت اسیدی و پاره ای حالت قلیایی دارند و این حالت سبب می شود که اعمال شیمیایی بین آنیون ها و کاتیون ها رنگ با مواد مذکور انجام گیرد که نتیجه آن رنگ گرفتن مواد خواهد بود.

ب: پروتئین که نخستین پایه ساختمان سلول های زنده می باشد، خاصیت آمفوتریک دارد یعنی بسته به غلظت یون هیدروژن در محیط می تواند هر دو حالت اسیدی و قلیایی را داشته باشد.

*ساختار های ویژه(کپسول-اسپور) :

*کپسول(یکی از اجزای سلولی خارج از دیواره ی سلولی):

اگر لایه به خوبی سازمانهدهی شده باشد و به سهولت از سطح آن کنده نشود به آن کپسول می گویند.معمولا کپسول و لایه ی مخاطی جنسشانا زپلی ساکارید است پس اصطلاح گلیکوکالیکس برای آنها استفاده می شود اما بعضی باکتری ها به نام باسیلوس آنتراسیس(عامل سیاه زخم),کپسولشان از پروتئینی است از جنس د-گلوتامیک اسید است.

نقش کپسول:

1)به بیماری زایی کمک می کند و د رمقابل فاگوسیتوز از آن حفاظت می کند.

2)کپسول مقدار زیادی آب دارد و باکتری را در برابر خشکی حفظ می کند.

3)مانع ورود ویروس و مواد سمی به داخل سلول می شود.

4)در اتصال به سطوح جامد از جمله بافت های میزبان نقش دارد.

5)باعث سر خوردن باکتری می شود.

*اندوسپور باکتری:

بعضی ازباکتری ها یگرم مثبت می توانند ساختار مقاوم و خفته ای به نام اندوسپور ایجاد کنند.اسپور به تنش های محیطی مثل اشعه ماورابنفش,حرارت,تشعشعات و عوامل ضد عفونی کننده و خشکی مقاوم است.اندوسپور ها به دلیل نفوذناپذیر بودن به اغلب رنگ ها با رنگ آمیزی به روش های ساده قابل مشاهده نیست.با رنگ آمیزی با متیلن بلو اسپور به صورت روشن دیده می شود.رنگ آمیزی اسپور با روش خاصی با رنگ مالاشیت گرین صورت می گیرد.

اسپور دارای پوشش هایی است:

1)خارجی ترین لایه اگزوسپوریوم: که یک لایه ی نازک و ظریفی است.

 2)لایه پوشش اسپور: از چند لایه پروتئین تشکیل شده است که نسبتا ضخیم است و عامل مقاومت به مواد شیمیایی است.این لایه دارای آنزیم هایی است که در تندش سلول نقش دارند.

 3)لایه ی کورتکس:ا ز پپتیدوگلیکان غیرطبیعی ساخته شده است.اتصالات عرضی آن نسبت به پپتیدوگلیکان طبیعی کمتر است.

4)دیواره ی سلول ساسپور که بخش مرکزی را در بر می گیردو دارای بخش هایی است به نام ریبوزوم و نوکلئوتید,ولی از لحاظ متابولیکی غیر فعال است.

دلایل مقاومت اسپور:

1)اسپور از کمپلکس دی پی کلینیک اسید-کلسیم ساخته شده است.مدت ها تصور می شد که عامل مقاومت اسپور داشتن دی پی است,اما بعدها موتانت هایی یافت شد که دی پی نداشتند امام مقاوم بودند.امروزه کلسیم را در مقاومت به حرارت دخیل میدانند.

 2)کلسیم و دی پی کلینیک اسید,نوکلئیک اسید یا دی ان ا اسپور را پایدار می کنند.

3)پروتئین های محلول د راسید کوچکی به نام SASPدر اسپور وجود دارد و DNA اسپور را اشباع می کند و آن را از حرارت و تشعشع حفظ می کند.

4)از دست دادن آب پروتوپلاست اسپور که به نظر می رسد کورتکس آب پروتوپلاست را با خاصیت اسمز حذف می کندو بدین ترتیب از آسیب های حرارت و تشعشع حفظ میکند.

5)پوشش اسپور در حفاظت اسپور در برابر آنزیم ها و مواد شیمیایی نقش دارد

6) آنزیم های ترمیم DNA

تشکیل اسپور یا اسپوروژنز:

وقتی شرایط نا مساعد می شود اسپور تشکیل می شود.در 7 مرحله تقسیم می شود.ابتدا مواد هسته رشته ای محوری ایجاد می کند بعد در غشا فرورفتگی ایجاد می شود و دور ماده ی هسته ای را می گیرد.غشا به پیشروی خود  ادامه می دهد بطوریکه 2 غشا اطراف DNA ار فرا می گیرد.در مرحاه بعد بین دو غشا کورتکس قرار م یگیرد.در این مرحله کلسیم و دی پی کلینیک اسید تجمع پیدا میکند.بهد اسپورکت در بین دو غشا تشکیل می شود و در نهایت اگزوسپورم ساخته می شود سر انجام آنزیم های لیتیک اسپرانژیم را تخریب می کنند و اسپور آزاد می شود.

تبدیل شدن اسپور به فرم رویشی در 3 مرحله:

1)فعالسازی 2)تندش 3)رشد

در فعالسازی به وسیله تیمار هایی مانند حرارت اسپور فعال می شود یعن یاگر حتی اسپور در شرایط مغذی نیز قرار گیرد به فرم رویشی تبدیل نیم شود مگر اینکه فعال شده باشد.در مرحله دومخ اسپور متورم شده پوشش اسپور پاره شده و مقاومتبه حرارت و سایر عوامل از دست می رود.فعالیت متابولیکی در اینجا شروع می شود.برای تندش موادی مانند اسیدآمینه یا قند ها مورد نیازند.بعد از این مرحله رشد که پروتوپلاست شروع به رشد می کند و فعالیت خودش را از سر میگیرد.

 

*ویژگی های باکتری مورد آزمایش:

Bactenum= باسیلوس سوبتی لیس

=Colony form مدور

=Colony elevation مسطح

=Colony margin نامنظم

=Colony size بزرگ

Colony color= کرم

مواد و وسایل  مورد نیاز آزمایش:

سوسپانسیون-کریستال ویوله-آب مقطر-لام-میکروسکوپ

روش آزمایش:

1)    ابتدا سوسپانسیون را در محیط اسکیم میلک یا سرم 10% تهیه کنید (باسیلوس سوبتی لیس)

2)    یک قطره بر روی لام تمیز قرار دهید.و با نگروزین آن را حل کنید و  تهیه گسترش توسط لام دیگر

3)    در معرض هوا بدون فیسکه کردن خشک کنید

4)    در کریستال ویوله به مدت 3 دقیقه قرار دهید

5)    با آب شستشو دهید

6)    لام  را توسط ميكروسكوپ باعدسي 40 مشاهده کنید

مشاهدات:

•         زمینه به رنگ آبی روشن

•         سلولها به رنگ آبی تیره

•         کپسول به رنگ آبی روشن و یا شفاف

نتیجه گیری:

سلول ها به صورت اجسام روشنی در میان زمینه ای آبی تیره ظاهر می شود.زیرا ذرات مرکب و رنگ نمی تواند از سلول و کپسول آن عبور کنند.بنابراین رنگ آمیزی کپسول مثالی از رنگ آمیزی منفی است.میزان وسعت نواحی روشن با اندازه کپسول و اندازه ی خود سلول تعیین می شود.در این روش تغییرات شکلی سلول اندک است و برای وضوح بیشترسلول می توان آن را با رنگ مخالف رنگ آمیزی کرد.در رنگ آمیزی کپسول مرحله ی حرارت حذف می شود زیرا حرارت شکل کپسول را تغییر می دهد.

اسپور:

باسیلوس سرئوس: که عامل مسمومیت غذایی بوده و علاوه براین می تواند به عنوان پاتوژن فرصت طلب عمل نماید. برخی از باسیلوسها به علت قدرت تخمیري زیاد باعث تجزیه مواد قندي و پروتئینی شده و در فساد مواد غذایی نقش دارند. این باکتریها به حالت ساپروفیت در

هوا، خاك ، آب ، شیر، سبزیجات ، گرد و غبار، مدف وع و ... زندگی می کنند، که از نظر شکل

ظاهري و رنگ آمیزي به باسیلوس آنتراسیس شباهت دارند و آنتراکوئید نامیده می شوند.

رنگ آمیزي اسپور:

دیواره اسپورها مانعی برای عبور مواد به داخل و خارج اسپور است. به این دلیل از افزایش زمان رنگ آمیزی  و حرارت براي نفوذ رنگ به اسپور استفاده می شود.

اسپورها به دو روش سبز مالاشیت و مولر رنگ آمیزی می شوند.

مواد و وسایل:

باسیلوس سرئوس-مالاشیت سبز-سافرانین-آب مقطر-لام

روش آزمایش:

رنگ آمیزي سبز مالاشیت,مالاشیت گرین

-1 گسترش   باسیلوس سرئوس را با حرارت ثابت نمایید.

-2 محلول سبز مالاشیت را روي گسترش ریخته و 5 دقیقه به ملایمت حرارت دهید تا

بخار متصاعد شود ولی رنگ نجوشد و خشک نشود.

-3 لام را با آب بشویید.

-4 محلول سافرانین روي گسترش ریخته و 30 ثانیهصبر کنید.

-5 لام را با آب بشویید.

پس از خشک کردن لام با استفاده از روغن ایمرسیون و عدسی 100 میکروسکوپ آن را مطالعه نمایید .

مشاهدات:

اسپورها به رنگ سبز وباسیلها به رنگ قرمز دیده می شوند