میکروبیولوژی هوا

مقدمه

تعداد میکرو ارگانیسمهای موجود در هوا در مقایسه با خاک و آب بسیار کم بوده و معمولا از نظر متابولیسمی فعال نیستند. در واقع هوا ، محیط زیست میکرو ارگانیسمها نیست، بلکه تنها محیط و وسیله انتقال فعال میکروبها می‌باشد. منشا میکرو ارگانیسمهای هوا می‌تواند گیاهی ، جانوری ، خاک ، آبهای طبیعی ، مواد غذایی و غیره باشد. تعداد و ترکیب میکرو ارگانیسمهای هوا در فضاهای بسته و باز و همچنین در محیطهای شهری و روستایی متفاوت است.

به منظور بررسی میکرو بیولوژیکی ، همراه شناخت و بررسی دقیق لایه‌های اتمسفر ، حرکات و جابجایی هوا ، شناخت اثر عوامل مختلف فیزیکی و شیمیایی بر تغییرات و جابجایی میکرو ارگانیسمهای هوا ضروری است. حرکات و جابجایی‌های هوا از مهمترین عوامل انتشار میکرو ارگانیسمها است و عمدتا در اثر تغییرات حرارتی ، باد ، حرکت موجودات زنده گیاهی و جانوری ایجاد می‌شود.

 

میکروبیولوژی هوا

هوای محیطهای باز

در هوای محیطهای باز ، معمولا میکرو ارگانیسمهای هوا دارای منشا گیاهی ، خاک و تا حدودی جانوری هستند. در هوای باز معمولا تعداد اسپور قارچها زیاد است.

هوای محیطهای بسته

میکرو ارگانیسمهای موجود در فضای بسته عمدتا از منابع انسانی هستند. ولی علاوه بر آن میکروبهای موجود در هوای بیرون نیز می‌توانند وارد آن شوند. برخی از سطوح و اشیا در فضای بسته نیز ممکن است از منابع انتشار میکروبی باشند.

جابجایی و انتشار میکروبها

جابجایی و انتشار میکروبها در هوای آزاد عمدتا از طریق باد ، جابجایی حرارتی به هنگام باد و تا حدودی حرکت موجودات است. در حالی که در محیطهای بسته فعالیتهای انسانی ، بیشترین تاثیر را در انتشار میکرو ارگانیسمها دارد و شامل میکروبهای سطح بدن جانوران و انسان و میکروبهای دستگاه تنفسی می‌باشد.

میکرو بیولوژی سطوح بدن جانوران و انسان

انسان و گونه‌های مختلف جانوران در سطح بدن خود میکروبهای مختلفی دارند که تراکم و تنوع آنها توسط عوامل زیر کنترل می شود.

• حرارت بدن
• مقدار کرک و پشم ، پر و غیره که در تعیین حرارت پوست موثرند.
• تغذیه موجود که در ترکیب ترشحات پوستی ، عرق و پوست دخالت دارند.

قارچهای سطح پوست عمدتا شامل مخمرها ، از جمله مخمر معروف کاندیدا آلبیکلنس هستند که به صورت ساپروفیت زندگی می‌کنند. مخمرهای دیگری نیز مانند پیتوسپورم اورال ، پیستیوسپورم اربیکولار ، بعضی از درماتوفیتهای بیماریزای متداول مانند میکروسپورم و تریکوفیتون نیز می‌توانند در پوست سالم به صورت ساپروفیت زندگی کنند. پوسته‌های بدن فرد بالغ حاوی باکتریهای مختلف و عمدتا گرم مثبت است. در حالی که در سطح پوست نوزادان ، بیشتر باکتریهای گرم منفی وجود دارد.

در دهان ، گونه‌های استرپتوکوک غالب هستند. استرپتوکوکوس موتانز در تخریب دندانها نقش مهمی دارد. بدن انسان یکی از مهمترین منابع میکروبی در محیطهای بسته و هوای باز مناطق شهری و پر تراکم است. میکروارگانیسمهای سطح پوست می‌توانند در اثر حمام کردن ، خشک کردن دست با حوله و تماس پوست با ملافه و به همراه بخشهایی از پوست در هوا آزاد شوند.

 

میکرو ارگانیسمها و دستگاه تنفسی انسان

دستگاه تنفسی مهمترین منبع میکروبی فضاهای بسته است. دستگاه تنفس انسان به گونه‌ای است که بسیاری از ذرات موجود در هوای تنفسی را در خود جای می‌دهد. این ذرات می‌توانند موجب عفونت و حساسیت شوند. جای گرفتن ذرات و میکرو ارگانیسمها در مجاری مختلف تنفسی ارتباط کامل با اندازه آنها دارد و پیشگیری از انتقال این بیماریها دارای اهمیت زیادی است. میکروارگانیسمهای دستگاه تنفس از طریق حرف زدن ، سرفه ، عطسه و غیره وارد هوا می‌شوند.

در عطسه که شدیدترین حالت ورود میکروبها به هوا است، در حدود 10 ذره بزاق با قطر 10 تا 100 میکرومتر وارد هوا می‌شود. میکربهای ذرات ریز آب ، بسرعت در اثر تبخیر این ذرات وارد هوا می‌شوند. تبخیر این ذرات در هوا در کمتر از یک ثانیه انجام می‌شود. جالب است بدانیم تعداد ذرات آب آزاد شده در هوا در اثر دو بار سرفه و یا 4000 کلمه حرف زدن در حدود 10 خواهد بود. ذرات آب حاصل از سرفه از جنس ترشحات حلق بوده که به مراتب غلیظ‌تر از بزاق است، در نتیجه اندازه این ذرات درشت تر است. بدیهی است هر قدر تعداد میکروبهای موجود در گلو و دهان بیشتر باشد، قطر این ذرات نیز بیشتر خواهد بود.

 

مراحل آزمایش:

ابتدا پلیت های حاوی محیط کشت NA و SDA را به مدت 30دقیقه یا 0/5 ساعت در محیط های مختلف قرار میدهیم(ما د راتاق اساتید قرار دادیم)

پلیت ها را به طور برگردان د ر30درجه انکوبه کرده

نتایج:

محیط NA:پلیت اول 73 کلنی

محیط NA:پلیت دوم 36کلنی

36+73=109/2=54/5

محیطSDA:پلیت اول 10 کلنی

محیطSDA:پلیت دوم 7 کلنی

10+7=17/2=8/5

 

میکروب شناسی آب:

 

میکروب شناسی آب:

آبی که به صورت باران,تگرگ و برف بر سطح زمین می ریزد دارای میکروب های موجود در هواست .هنگام نزول باران مقدار قابل ملاحظه ای از میکروارگانیسم های هوا کاسته می شود.آب باران پس از شستن سطح خاک به طرف دریاچه ها و اقیانوس عا سرازیر می شود و میکروبهای هوا و خاک را با خود به طرف منابع طبیعی آب میبرد.آبی که از طبقات مختلف زمین عبور می کند و به قسمت های عمیق خاک میرود در مراحل مختلف اکثر میکروبهای خود را از دست می دهد.در حقیقت طبقات مختلف زمین مانند صافی عمل کرده جمعیت میکروبهای اینگونه آبها را کم می کنند.به طور کلی چون منشا آبهای مختلف با یکدیگر تفاوت دارند لذا نوع میکروارگانیسم های موجود در آنها نیز با هم متفاوت اند.

مباحث مختلف میکروب شناسی آب شامل میکروب شناسی اقیانوس ها ,دریاها,تالابها,حوضچه ها,نهرها,رودخانه ها,آب آشامیدنی و فاضلابهاست.

چون آب قادر به حمل میکروارگانیسم های مختلف است لذا می تواند یکی از عوامل مهم و اساسی مؤثر در بهداشت یک منطقه باشد.عوامل بیماریزا که توسط آب منتقل می شوند بیشتر در دستگاه گوارش بیماری تولید می کنند.عوامل بیماریزا در مدفوع افراد آلوده وجود دارند و چنانچه این عوامل در شرایطی از طریق فاضلاب ها با آب آشامیدنی تماس حاصل کنندباعث بروز بیماری در افراد سالم می گردد.آبی که فاقد میکروارگانیسم های بیماری زا و مواد شیمیایی زیان آور باشد “آب آشامیدنی” و آبی که به وسیله فاضلاب آلوده شده باشد “آب آلوده ” خوانده می شود.

تشخیص آلودگی آب از نظر باکتری شناسی:

آبی که کاملا شفاف و بدون بو و طعم است ممکن است آلوده به میکروارگانیسم باشد.آزمایشهای باکتری شناسی برای تشخیص میزان آلودگی آب فقط مربوط به تشخیص عوامل بیماری زای موجود در آب نیستزیرا عوامل بیماری زا به  تعداد خیلی کم وارد آب می شوند و اکثراً پس از ورود به آب برای مدت طولانی قادر به ادامه زندگی نیستند .در نتیجه برای تشخیص آلودگی آب وجود گروهی از باکتری هاکه در حالت طبیعی در روده ی انسان و جانوران زندگی می کنند و به نام کلی فرم ها موسوم اند و همچنین استرپتوکوکوس فکالیس,کلاستریدیوم ولشی ای ,کلاستریدیوم پرفرژنس در آب جستجو می شوند.

تشخیص انواع ذکر شده در آب دلیل بر آلودگی آن توسط مدفوع است و از طرفی چون عوامل بیماری زا از طریق مدفوع افراد آلوده وارد آب می شوند,وجود و تشخیص انواعی از باکتری ها مانند کلی فرم ها در آب دلیل بر آلودگی آب توسط مدفوع است.انتخاب کلی فرم ها به ویژه گونه اشریشیاکلی به عنوان شاخص آلودگی به این علت است که این باکتری در روده ی آدمی به تعداد زیادی وجود دارد و در مقایسه با انواع باکتری های بیماری زا مدت طولانی تری در آب زنده می ماند.کلی فرم ها گروهی از باسیل های گرم منفی بدون هاگ هوازی یا بی هوازی اختیاری و تولید کننده ی گاز در محیط واجد لاکتوز هستند.نمونه های اصلی این گروه از باسیل ه عبارتند از اشریشیا کلی و انتروباکتر آئروژنز.

برای تشخیص آلودگی آب وهنگام نمونه برداری رعایت نکات زیر ضروری است:

۱-      نمونه ها باید تحت شرایط سترون و در بطری های سترون گرفته شوند

۲-      نمونه ها باید معرف مخزنی باشند آب از آن مصرف شده است

۳-      هنگام نمونه برداری باید دقت شود آلودگی اضافی رخ ندهد

۴-      جهت از بین بردن (خنثی کردن ) کل موجود در آب باید در داخل بطری نونه گیری قبل از استریلآن مقداری کریستال تیوسولفات سدیم ریخت

۵-      نمونه ها باید هرچه زودتر پس از جمع آوری مورد آزمایش قرار گیرند و چنانچه آزمایش آب با تأخیر همراه باشدنمونه ها باید در دمای بین صفر تا ۱۰ درجه سانتی گراد نگه داری شوند.

آزمایش های باکتری شناختی که جهت تشخیص آلودگی آب انجام می شود عبارتند از:

۱-      آزمایش برای تشخیص کلی فرم ها در آب

۲-      شمارش تعداد باکتری های موجود در آن

شمارش تعداد باکتری ها در آب:

روش کار:

۱-      برای شمارش تعداد باکتری ها در آب دو نمونه آب لوله کشی و آب نهر را انتخاب کرده

۲-      در مورد آب نهر آن را تا رقت ⁵ ̄ ۱۰ رقیق کنید و آب لوله کشی را بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار دهید

۳-      از آب های مورد استفاده روی پلیت ها کشت می دهیم و پلت ها را ۴۸ ساعت در گرمخانه ی ۳۵ درجه سانتی گراد بگذارید سپس به بررسی و شمارش تعداد کلنی ها یا تعداد باکتری های موجود در ۱ سی سی از آب بپردازید.

از روی تعداد کلی باسیل های موجود در آب آبها را به سه دسته زیر تقسیم می کنند:

الف – آب بسیار خوب که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن کمتر از یک اشریشیا کلی وجود دارد

ب – آب خوب که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن یک تا دو اشریشیاکلی وجود دارد

ج – آب مشکوک که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن بیش از ۱۰ اشریشیاکلی وجود دارد

 

تشخیص کلی فرم ها در آب:

برای شناسایی و شمارش کلی فرم ها محیط های انتخابی و افتراقی و روش خاصی لازم است.به این منظور دو روش اساسی شناخته شده است: الف – روش MPN (Most probable Number ) ب – روش فیلتر غشایی

الف – روش MPN :در این روش کلی فرم ها را در چند مرحله شناسائی می کنند: ۱- مرحله احتمالی ۲- مرحله تأییدی ۳- مرحله تکمیلی. در مرحله احتمالی رقت هایی از نمونه آب را به لوله های محتوی لاکتوز براث دار  اضافه کرده و آنها را تا ۲۴ الی ۴۸ ساعت در گرمخانه قرار می دهند.تخمیر لاکتوز به اسید و گاز نشانه مثبت بودن واکنش است. در آزمایش احتمالی متداول در ۱۵ لوله حاوی محیط کشت نمونه آب را کشت میدهند (در هر یک از ۵ لوله اول ۱۰ میلی لیتر ,در ۵ لوله دوم یک میلی لیتر و در ۵ لوله سوم ۱/۰ میلی لیتر) .اگر اسید و گاز در هیچ یک از لوله ها پیدا نشود آب از نظر بهداشتی رضایت بخش در نظر گرفتته می شود و از نظر آماری این حالت نشانگر کمتر از ۲/۲ کلی فرم در هر ۱۰۰ میلی لیتر آب است .

هرگاه یک سری از لوله ها در آزمایش احتمالی نتیجه مثبت نشان دهند,تست اضافی انجام می گیرد زیرا میکروب های دیگری غیر از کلی فرم ها می توانند لاکتوز را با تولید گاز تخمیر نمایند. در آزمایش تأییدی از لوله های مثبت برداشت کرده و بر روی محیط افتراقی (ائوزین متیلن بلو آگار ) و اندوآگار به طور خطی کشت می دهند.با توجه به اینکه کلی فرم ها از لاکتوز اسید تولید می کنند لذا کلنی هایی با مرکز تیره رنگ ایجاد می کنند .در عین حال اشریشیاکلی کلنی های بزرگ با مرکز تیره رنگ با درخشندگی ویژه,متمایل به سبز ایجاد می کند که علت ایجاد این درخشندگی یا جلای فلزی سبز ,آزاد شدن آزاد شدن ائوزین از محیط E.M.B و اکسید شدن آن در مجاورت هواست .ائوزین در محیط به صورت ترکیب با سولفیت سدیم است.در اثر رشد اشریشیاکلی از تخمیر لاکتوز ماده حدوسطی از جنس استالدئید تشکیل می شود که این ماده با سولفیت سدیم ترکیب شده سبب آزاد شدن معرف ائوزین می گردد.

پیدایش این نوع کلنی ها نشانگر مثبت بودن آزمایش تأییدی است.در آزمایش تکمیلی تک تک کلنی ها را از محیط تأییدی برداشت کرده و در لاکتوز براث دار و همچنین در محیط TSI ,24 ساعت در ۳۵ درجه قرار می دهند.هرگاه در این محیط ها اسید و گاز ایجاد شود و کلنی جدا شده گرم منفی , میله ای شکل و بدون اسپور باشد نتیجه آزمایش تکمیلی را مثبت اعلام می کنند.

ب)کلی فرم ها را همچنین می توان با روش فیلترهای غشائی نیز شناسایی کرد. بدین ترتیب ۱۰۰ میلی لیتر از آب مورد آزمایش را از فیلتر غشائی که قطر منافذ آن ۴۵/۰ میکرون است عبور می دهند.باکتری ها بر سطح فیلتر باقی می مانند,آنگاه پالایه را بر روی محیط کشت قرار می دهند.باکتری های کلی فرم بر روی فیلتر آغشته به ماده غذایی کلنی هایی مشخص رشد می کنند.هرگاه فقط یک کلنی از این ۱۰۰ میلی لیتر آب رشد کند آب را معمولاٌ از نظر آشامیدن سالم و بهداشتی می شناسند.

 نتایج:

مرحله ی تخمینی:

هر 3 لوله در هر 3رقت 10ml  1ml  0/1mlدارای کدورت و ایجاد گاز دز لوله درهام بودند

مرحله ی تائیدی:

د رمحیط کشت EMB, E.coli جلای فلزی سبز و انتروباکتر کلنی های صورتی تشکیل داد.

د رمحیط کشت اندوآگار, E.coli کلنی های صورتی و انتروباکتر بی رنگ بود

مرحله ی تکمیلی:

محیط سیترات:آبی شده بود و احتمالا E.aerogenesکه تست سیرات آن مثبت است وجود داشته

محیطN.A:چون رنگش زرد مانده احتمالا E.coli نبوده

mRvp: نمونه را به طور مساوی به 2لوله منتقل کرده سپس معرف متیل رد را به یکی اضافه کرده =قرمز شد+

معرف koH 4قطره اضافه کرده بلافاصله متیل رد= زرد شد تست منفی است

محیط لاکتوز براث:گاز دارد و رشد و کدورت

تفسیر: 

محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth (MR-VP)

 

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرمها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.

آزمایش  MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت ، مقدار 6/0 میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.                                                                         

                                                                                                                                                  

نتیجه: ظهور رنگ قرمز---------آزمایش مثبت  (PH=4/4)

        ظهور رنگ نارنجی-------آزمایش مثبت ضعیف(PH=5/3)

        ظهور رنگ زرد ---------آزمایش منفی (PH=5/3)

.

  آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود6/0 میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار 2/0 میلی لیتر محلول پتاس (معرف B)  اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی  تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت ،واگر تغییر رنگی صورت نپذیرد ، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه: مثبت=  ظهور رنگ صورتی تا قرمز

        منفی=  تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

 

محیط کشت سیمون سیترات  آگار  Simmons Citrate agar

 

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتریهایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند.در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط  آزمایش سیترات منفی است. 

 محیط کشت لاکتوز براث

تایید برای تولید گاز و مشاهده ی کدورت

محیط کشت N.A

تائید برای اینکه رنگ صورتی یا سیاه مربوط به خودش است یا خیر در E.coli

چرخه ی نیتروژن

حدود 78 درصد از جوّ زمین را نیتروژن تشکیل داده است. مقدار معینی از این نیتروژن، به طور مداوم از جوّ گرفته و به آن بازپس داده می شود. به گردش مداوم نیتروژن بین خاک، آب، هوا و موجودات زنده «چرخه ی نیتروژن» می گویند. تمام موجودات زنده برای ادامه ی حیات به نیتروژن احتیاج دارند. در واقع نیتروژن یکی از اجزای تشکیل دهنده ی پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک است که وجود هر دو برای ادامه ی حیات ضروری است.

قسمتی از نیتروژن موجود در هوا هنگام رعد و برق از آن جدا می شود. تخلیه ی ناگهانی بار الکتریکی باعث می شود مقداری از اکسیژن و نیتروژن موجود در هوا با هم ترکیب شوند و اکسیدهای نیتروژن به وجود آید. اکسیدهای نیتروژن پس از حل شدن در آب با سایر عناصر ترکیب می شوند و ترکیبات نیتروژن دار تولید می کنند.

برخی از باکتریها و جلبکها نیز نیتروژن موجود در هوا را جذب می کنند. باکتریهای خاصیّ که در ریشه ی برخی از گیاهان مثل نخود، لوبیا، نخودفرنگی و غیره وجود دارند، نیتروژن هوا را به طور مستقیم جذب می کنند و در اختیار گیاه قرار می دهند.

گیاهان با استفاده از نیتروژن، پروتئین می سازند و جانوران با خوردن گیاهان، این پروتئینها را وارد بدن خود می کنند.

گیاهان و جانوران پس از مرگ توسط تجزیه کنندگان موجود در خاک تجزیه می شوند. به این ترتیب ترکیبات نیتروژن دار وارد خاک شده، توسط گیاهان مصرف می شوند. جانوران، ترکیبات نیتروژن دار را با خوردن گیاهان یا سایر جانوران گیاهخوار وارد بدن خود می کنند.

باکتریهای تجزیه کننده ی موجود در خاک مقداری از ترکیبات نیتروژن دار خاک را به نیتروژن گازی شکل تبدیل می کنند. به این ترتیب تقریباً همان اندازه نیتروژنی که از هوا گرفته و مصرف می شود، مجدداً به آن باز می گردد.

در واقع نیتروژن موجود در هوا از خاک، اندامهای مختلف گیاهان و بدن جانوران عبور می کند و در نهایت دوباره هوا می شود. این کار ممکن است هزاران و یا حتّی میلیونها سال طول بکشد؛ ولی هر مولکول نیتروژن سرانجام به هوا باز می گردد.

نتایج:

نیترات	نیتریت	نسلر	محیط/معرف
-         /بی رنگ	-/بی رنگ	+/نارنجی	آمونیوم
-/بی رنگ	-/بی رنگ	-/بی رنگ	نیتریت
+/آبی	+/صورتی	-/بی رنگ	نیترات

 

 

تفسیر:

نیترات	آبی+
نیتریت	صورتی+
آمونیوم (نسلر)	نارنجی+
بی رنگ	-

 

در لوله ی حاوی آمونیوم:

به دلیل تولید آمونیوم ,معرف نسلر نارنجی شده است.

تست معرف نیتریت و نیترات منفی شده و عدم حضور این دو را بیان میکند.

در لوله ی حاوی نیتریت:

عدم تجزیه نیترات,پس هر 3 تست منفی است.

در لوله ی حاوی نیترات:

بدلیل تجزیه نیترات و تبدیل آن به نیتریت تست: معرف نیتریت +صورتی

بدلیل تجزیه نیترات:تست معرف نیتریت +آبی

مرحله ی تجزیه نیتریت به آمونیوم صورت نگرفته :- بی رنگ

 

 

بررسی مورفولوژی کلنی ها و شمارش تعداد باکتری های خاک به شیوه ی pour plate method

بررسی مورفولوژی کلنی ها و شمارش تعداد باکتری های خاک به شیوه ی pour plate method

هدف از این آزمایش تعیین تعداد باکتری های موجود در یک نمونه ی خاک می باشد. در این شیوه در واقع تعداد باکتری های زنده شمارش می شود. برای انجام آزمایش ابتدا نمونه های با رقت های مختلف از باکتری های موجود در خاک تهیه کردیم. برای این منظور ابتدا با اضافه کردن 1 گرم خاک به 9cc آب استریل 10ml محلول با رقت 0.1 از باکتری های خاک تهیه کردیم. برای تهیه ی رقت 0.01 از باکتری های موجود در خاک 1ml از نمونه ی موجود در لوله ی شماره ی 1 را به 9ml آب سترون اضافه کردیم. برای تهیه ی رقت های بیشتر هر بار 1ml از محلول موجود در لوله را به لوله ی بعدی که حاوی 9ml آب مقطر بود اضافه کردیم و به این ترتیب رقت های 10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5 از باکتری های موجود در خاک به دست آمد. برای شمارش تعداد باکتری ها نیاز به کشت باکتری و شمارش کلنی های حاصل بود. برای این منظور از محیط کشت NA استفاده کردیم. مسلما تعداد باکتری های موجود در لوله ی شماره ی 1 که حاوی باکتری با رقت 0.1 است بسیار بیشتر از محدوده ی 300-30 (محدوده ی قابل شمارش) می باشد بنابراین از لوله ی شماره ی 1 کشتی تهیه نشد. برای تهیه ی کشت ابتدا 0.1ml از نمونه ی موجود در هر لوله را به پلیت سترون منتقل کردیم و سپس NA مذاب را در دمایی که باعث مرگ باکتری ها نشود به پلیت منتقل کردیم و برای اینکه باکتری ها به خوبی در محیط کشت پراکنده شوند پلیت محتوی محیط کشت و باکتری ها را به آرامی به صورت حرکت 8 جابجا کردیم و در انکوباتور قرار دادیم.

 

 

 

شمارش :

تعداد کلنی های موجود در لوله ی شماره ی 2 (10^-2) غیر قابل شمارش بود. در لوله ی شماره ی 5 (10^-5) تقریبا کلنی مشاهده نمی شد (کمتر از 30 کلنی) بنابراین فقط تعداد کلنی ها ی موجود در پلیت های مربوط به لوله های 3 (10^-3) و 4 (10^-4) شمارش شدند که نتایج در جدول زیر خلاصه شده است :

شماره لوله	رقت	تعداد کلنی شمارش شده	تعداد باکتری
3	10^-3	139
4	10^-4	48

 

برای محاسبه ی تعداد باکتری های موجود در نمونه ی خاک تعداد کلنی های شمارش شده در هر پلیت را در عکس ضریب رقت لوله ی مربوط به آن پلیت ضرب می کنیم . ضمنا چون 0.1ml از هر نمونه به پلیت منتقل شده است باید در 10 نیز ضرب شوند.

جداسازی و شمارش میکروارگانیسم های خاک به روش کشت

موضوع:

 جداسازی و شمارش میکروارگانیسم های خاک به روش کشت

هدف:

 از این آزمایش تعیین تعداد باکتری های موجود در یک نمونه ی خاک می باشد. در این شیوه در واقع تعداد باکتری های زنده شمارش می شود.

مقدمه:

 یك قاشق چايخوری از خاك فعال حاوی ميليون ها موجود زنده است که بعضی منشاء حيوانی و بعضی ديگر منشاء گياهی دارند. ارگانيسم‌ ها از نظر اندازه بسيار متفاوت هستند . بعضی از آنها با چشم غير مسلح نيز قابل دیدن هستند مانند كرم خاكی، دم فنری، كنه دامی. اكثر آنها بسيار كوچک بوده و فقط با ميكروسكوپ ديده می شوند بنابراين ميكروارگانيسم ناميده می شوند.

مهمترين ميكروارگانيسم ها باكتری‌ها، و پروتوزوآها هستند. ميكروارگانيسم ها عناصر كليدی كيفيت و باروری خاك هستند اما برای ما انسان ها بطور غير قابل دیدن اين كار را انجام می دهند. آنها دارای گونه های زيادی هستند و هر چه تعداد آنها بيشتر باشد، بیشتر باعث حاصلخيزی طبيعی خاك می شوند.

به طور مثال برخی از ارگانيسم های بزرگ خاک عبارتند از: کرم خاکی، عنکبوت، حلزون، لیسه، سوسک، دم فنری ها، کنه ها و هزارپا.

بعضی از ميكروارگانيسم های خاک عبارتند از: باکتری ها، جلبک ها، قارچ ها، پروتوزوآها و اکتینومیست ها.

تأثیرات مهم ميكروارگانيسم های خاک:

1 - به تجزيه مواد ارگانيك كمك كرده و باعث توليد هوموس (ماده ی بیوشیمیایی مفید حاصل از ترکیب مواد آلی و معدنی) می شوند.

2- باعث مخلوط شدن مواد ارگانيك با ذرات خاك شده و اين امر باعث توليد ذرات پايدار خاك می شوند.

3- با ايجاد تونل‌هايی در خاک، باعث تشويق ريشه دوانی گياهان و نیز تهويه بهتر خاك می شوند و همچنين باعث آزاد شدن مواد غذايی از ذرات معدنی می‌‌‌ گردند.

4- باعث كنترل آفات و ارگانيسم های بيماريزا كه روی ريشه گياهان اثر می‌ گذارند، می شوند.

5- اغلب ارگانيسم های خاك به تغييرات رطوبت و دمای خاك خيلی حساس هستند. از آنجا كه ريشه گياهان و ارگانيسم های خاك از هوا استفاده می كنند جريان هوای خوب در خاك برای توسعه و رشد آنها بسيار مهم است. فعاليت ارگانيسم های خاك هنگامی كه خاک خيلی خشك، خيلی مرطوب و يا خيلی گرم باشند كاهش می يابد. ميكرو ارگانيسم ها بيشترين نقش را در تعادل هوای گرم و مرطوب خاك و وجود مواد غذايی دارا هستند.

مراحل آزمایش:

برای انجام آزمایش ابتدا نمونه های با رقت های مختلف از باکتری های موجود در خاک تهیه کردیم. برای این منظور ابتدا با اضافه کردن 1 گرم خاک به 9cc آب استریل 10ml محلول با رقت 0.1 از باکتری های خاک تهیه کردیم. برای تهیه ی رقت 0.01 از باکتری های موجود در خاک 1ml از نمونه ی موجود در لوله ی شماره ی 1 را به 9ml آب سترون اضافه کردیم. برای تهیه ی رقت های بیشتر هر بار 1ml از محلول موجود در لوله را به لوله ی بعدی که حاوی 9ml آب مقطر بود اضافه کردیم و به این ترتیب رقت های 10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5 از باکتری های موجود در خاک به دست آمد. برای شمارش تعداد باکتری ها نیاز به کشت باکتری و شمارش کلنی های حاصل بود. برای این منظور از محیط کشت NA استفاده کردیم. مسلما تعداد باکتری های موجود در لوله ی شماره ی 1 که حاوی باکتری با رقت 0.1 است بسیار بیشتر از محدوده ی 300-30 (محدوده ی قابل شمارش) می باشد بنابراین از لوله ی شماره ی 1 کشتی تهیه نشد. برای تهیه ی کشت ابتدا 0.1ml از نمونه ی موجود در هر لوله را به پلیت سترون منتقل کردیم و سپس NA مذاب را در دمایی که باعث مرگ باکتری ها نشود به پلیت منتقل کردیم و برای اینکه باکتری ها به خوبی در محیط کشت پراکنده شوند پلیت محتوی محیط کشت و باکتری ها را به آرامی به صورت حرکت 8 جابجا کردیم و در انکوباتور قرار دادیم.

نتایج:

محیط کشت SEA:

10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
13	25	109	202

 

محیط کشت N.A:

10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
51	غیر قابل شمارش	67	179

 

محیط کشت SDA:

10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
1	5	10	31

 

 

محاسبات:

 

 

 

 

 

برای محاسبه ی تعداد باکتری های موجود در نمونه ی خاک تعداد کلنی های شمارش شده در هر پلیت را در عکس ضریب رقت لوله ی مربوط به آن پلیت ضرب می کنیم . ضمنا چون 0.1ml از هر نمونه به پلیت منتقل شده است باید در 10 نیز ضرب شوند.

محیط کشت SEA:  

202+109=311

2=155/5÷311  میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

N=155/5 ÷(10^-4 +10^-5)=14136363.63

 

محیط کشت N.A:

179+67+51=297

3=99÷297  میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

N=99÷(10^-4 +10^-5+10^-7)=99×8991825.61

 

محیط کشت SDA:

1=31÷ 31میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

N=31÷(10^-4)=3100000

 

موضوع:بررسی تنوع و آرایش میکروارگانیسم ها به روش لام خاک مدفون

موضوع:بررسی تنوع و آرایش میکروارگانیسم ها به روش لام خاک مدفون

مقدمه

روش لام خاک مدفون توسط راس و کلدنی ابداع شده است.

خاک به عنوان یکی از مهمترین اکوسیستم‌های میکروبی محل رشد و تکثیر انواع مختلف میکروارگانیسمها است. وسیعترین تعداد میکروارگانیسمهای شناخته شده در خاک یافت می‌شوند. انواع میکرو ارگانیسمهای مختلف از جمله باکتریها، قارچها ، جلبکها ، گلسنگها و پروتوزوآها در خاک یافت می‌شوند و باکتریها فراوان‌ترین میکروارگانیسمهای موجود در خاک هستند.

باکتریهای خاک شامل آرتروباکتریها ، سودوموناسها ، باسیلهای اسپورزا ، باکتریهای میله‌ای غیر اسپورزا ، اکتینومیستها و سیانوباکتریها هستند.

 

 

آرتروباکترها

این باکتریها از نظر تعداد جنس ، در خاک غالب هستند. این باکتریها چند شکلی بوده و از نظر واکنش گرم متغیر هستند. سلولهای آنها در مراحل اولیه رشد میله‌ای شکل و ^-G و در مراحل بعدی میله‌ای کوتاه و یا کروی ⁺G است. بسیاری از آرتروباکترها دارای تحرک ضعیف هستند. از آنجا که طیف وسیعی از مواد موجود در خاک به عنوان ماده اولیه متابولیسمی آنها مورد استفاده قرار می‌گیرند، لذا این باکتریها در خاک پراکندگی وسیعی دارند. این باکتریها دارای سرعت رشد کم بوده و قدرت رقابت زیادی ندارند.

آدوموناسها

باکتریهای سودوموناس میله‌ای راست یا خمیده ^-G و دارای تاژههای قطبی هستند. این باکتریها به جز گونه‌های دینترینیه همگی هوازی هستند. برخی از گونه‌های این جنس برای گیاهان بیماری‌زا بوده و بسیاری دیگر که غیر بیماری‌زا هستند با گیاهان ارتباط نزدیکی دارند. سودوموناسها به قندها ، اسیدهای آمینه ، الکلها ، چربیها و بسیاری از سموم حمله کرده و آنها را به عنوان ماده غذایی مورد استفاده قرار می‌دهند. بسیاری از گونه‌های این جنس ، بویژه در محیطهای فقیر از نظر آهن ، مولد رنگدانه‌های فلورسانت هستند و این مواد در انتقال آهن سه ظرفیتی مشابه EDTA عمل می‌کنند. گونه‌های گرانتوموناس برای بسیاری از گیاهان بیماری‌زا بوده و بسیاری از آنها را از روی میزبان اختصاصی شناسایی می‌کنند. بطور کلی سودموناسها بین 5 تا 20 در صد کل باکتریهای شماره شده خاک در سطح پلیت 1 تشکیل می‌دهد.

باسیلهای اسپورزا

اعضای جنس باسیلوس باکتریهای ⁺G نامتغیر از نظر واکنش گرم و اغلب متحرک هستند. این اسیلها می‌توانند از نوع هوازی مطلق یا بی هوازی مطلق و یا هر دو باشند. این باکتریها در اثر تخمیر گلوکز می‌توانند محصولاتی مانند اتانول ، H₂ ، استن و اسیدهای استیک ، فورمیک ، لاکتیک و سوکسینیک را تولید کنند. یک گونه از این جنس (باسیلوس پلی میک) قادر به تثبیت ازت مولکولی است، و چند گونه دیگر قادر به تولید آنتی بیوتیک هستند. سم تولید شده توسط باکتری باسیلوس تورینجیز برای بسیاری از حشرات بسیار سمی است. بعضی از گونه‌های بی‌هوازی از جنس کلستریدیوم مثل کلستریدیوم بوتریکوم و کلستریدیوم پاستوریانوم قادر به تثبیت ازت مولکولی هستند.

 

باکتریهای میله‌ای غیر اسپورزا

ازتوباکتریها از مهمترین باکتریهای خاک هستند که در حالت آزاد |ازت ملکولی را تثبیت می‌‌کنند. ریزوبیومها و برادی ریزوبیومها از باکتریهای تثبیت کننده ازت در حالت همزیستی با گیاهان هستند، که پراکندگی آنها در خاک موجب افزایش حاصلخیزی خاک می‌شود. نیتروزموناسها و نیتروباکترها به عنوان عامل نیتریفیکاسیون در خاک شناخته شده‌اند. لاکتوباسیلها از جمله ارگانوترونهای تخمیرگر هستند که به دلیل قدرت تولید اسید لاکتیک به این نام خوانده می‌شوند. انتروباکترها از دیگر باکترهای تخمیرگر هستند.

اکتینومیستها

اکتینومیستها یکی از مهمترین گروههای میکروبی خاک را تشکیل می‌دهند. این گروه شامل 5 نوع میکرومونوسپورا ، نوکاردیا ، استرپتومیسس ، استرپتو اسپورانزیوم و ترمواکتینومیسس هستند که از میان آنها جنس استرپتومیسس 90% از اکتینومیسیتهای جدا شده از خاک را تشکیل می‌دهد. بسیاری از استرپتومیستها مولد آنتی بیوتیک هستند.

 

سیانوباکتریها

سیانوباکتریها ، پروکاریوتهای فتوسنتز کننده ، کلروفیل‌دار بوده و حاوی رنگدانه‌هایی مانند فیکوسیانین نیز می‌باشند. سیانوباکتریها به صورت تک سلولی ، توده‌ای یا رشته‌ای دیده می‌شوند و سیانو باکتریها دارای حرکت کند و خزنده هستند. در سیتوپلاسم این باکتریها اجزا فتوسنتز کننده موسوم به تیلاکوئید وجود دارند که در سطح آنها ذرات حاوی رنگدانه یافت می‌شود. سیانو باکتریها به صورت همزیست با پاره‌ای از گیاهان یافت می‌شوند. به علاوه این گروه باکتریها می‌توانند در تثبیت ازت مهم باشند. شواهدات نشان می‌دهند که هسته و سیستمها محل تثبیت ازت بوده و ترکیبات از این سلولها به سلولهای مجاور انتقال می‌یابد.

 

روش آزمایش:

لام ها را به مدت 3هفته در زیر خاک باغچه مدفون نمودیم تا میکروارگانیسم ها روی آن رشد کنند.

2لام در نظر گرفتیم که به سطح یکی از لام ها توسط سوآپ NAمحیط کشت  زدیم تا میکروارگانیسم ها بتوانند تغذیه کنند.و لام ها را با پارافین به هم چسباندیم تا فقط در یک سطح رشد کنند تا کار مشاهده آسانتر باشد.

لام ها را در ظرف حاوی خاک گذاشتیم  (3هفته)

لام را فیکس کردیم

رنگ آمیززی گرم انجام دادیم

میکروسکوپ مشاهده

مشاهدات:

آکتینومیست

عنوان آزمایش: جداسازی و شمارش میکروارگانیسم های خاک به روش کشت

عنوان آزمایش: جداسازی و شمارش میکروارگانیسم های خاک به روش کشت

هدف:

روش شمارش باکتری های زنده

مقدمه:

شمارش باکتری‌ها

در آزمایش‌های میکروبی باید بتوانیم تعداد باکتری‌ها را بشماریم. این شمارش می‌تواند در یک‌سان‌سازی دوز مصرفی باکتری یا مقایسه و سنجش اثر یک ماده بر شمار باکتری‌ها به کار برده شود. روش‌های گوناگونی برای شمارش باکتری‌ها به کار می‌رود که به هدف شمارش، امکانات موجود و مایع یا جامد بودن کشت باکتری بستگی دارد.

روش تهیه‌ی رقت:

ابتدایی‌ترین روش شمارش باکتری‌ها کشت دادن حجم خاصی از سوسپانسیون آن‌ها روی محیط کشت می‌باشد. در این روش حجم خاصی از سوسپانسیون باکتری روی محیط کشت جامد کشت داده می‌شود و پس از سپری‌شدن زمان لازم برای رشد باکتری، تعداد کلنی‌ها شمارش می‌شود (اگر این حجم خیلی کم باشد دقت کار پایین می‌آید). هر کلنی به توده‌ای از باکتری‌ها گفته می‌شود که در نتیجه‌ی رشد یک عدد باکتری اولیه روی محیط جامد ایجاد شده است.

بنابراین پس از رشد، می‌توان تعداد کلنی‌ها را برابر با تعداد باکتری‌ها در سوسپانسیون اولیه در نظر گرفت. ایراد این روش، فراگیر نبودن آن می‌باشد. زیرا در صورتی که تعداد باکتری‌ها خیلی زیاد باشد، آن‌ها تمام سطح پلیت را می‌پوشانند و تفکیک و شمارش تعداد کلنی‌ها ممکن نیست. از طرفی برخی میکروب‌ها ممکن است روی محیط جامد قابل کشت نباشند. اما با این حال هنوز این روش در بسیاری موارد کاربردی و مفید است.

شمارش کلونی ها:

دو روش برای شمارش کلونی ها وجود دارد:

الف) دستگاه کلونی کانتر که به طور اتوماتیک تعداد کلونی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.

ب) روش دستی که پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دارد و با علامت گذاری خانه ها تعداد را بدست می آوردند.

 روش محاسبه:

الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد)← جهت شمارش پلیت هایی انتخاب شوند که بین 30 تا 300 کلونی داشته باشند که برابر میانگین تعداد کلونی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته.

ب) محاسبه تخمینی← اگر در تمام رقت ها بیش از 300 کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلونی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلونی گزارش می کنند.

کشت در پلیت : به سه روش قابل انجام است .

1-        کشت خطی

2-        کشت سطحی

3-        کشت آمیخته یا پورپلیت

کشت سطحی :

در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود.

نحوه کشت :

این روش کشت بیشتر برای محیطهای مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیسمهای موجود در آن را مشخص نمود.

برای اینکار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه نمائید. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانید کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنید توجه داشته باشید که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .

چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یک گرمخانه با دمای 50-25 درجه قرار داده و خشک نمود.به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهید تا قطرات رطوبت حذف گردد.

همچنین می توانید پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائید. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

کشت آمیخته  یا پورپلیت :

در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد . یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آنرا در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده بمیزان 15-20 سی سی به پلیت اضافه نمائی. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آنرا کاملا مخلوط کنید. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیز کشت بپوشانید دراینحالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

برای انجام این آزمایش به ابزار زیر نیازمندیم:

پلیت ، لوله آزمایش ، پیپت ، سرم فیزیولوژی ، محیط کشت نوترینت آگار و...، دستگاه کلونی کانتر ، انکوباتور ، سوسپانسیون باکتری خاک

شرح آزمایش:

90ccسرم فیژیولوژی سالین, 0/9درصد +10گرم خاک باغچه را در ارلن بریزید

ارلن را به مدت 15 دقیقه بر روی شیکر 250دور قرار دهید

6لوله ی آزمایش بردارید در هر کدام 9ml سرم بریزید.

1ml از سوسپانسیون را به لوله ی شماره ی 1 بریزید.

شیکر انجام دهید

از لوله ی شماره ی 1 , 1ml برداشته به لوله ی شماره 2 بریزید

شیکر انجام دهید

.....

تا لوله ی شماره ی 6 این کار را انجام دهید

بعد از لوله هایی با غلظت 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 به میزان 1ml با پیپت برداشته و به محیط کشت های مختلف(محیط کشت SEA,N.A, (SDAمنتقل کنید و با میله ی L به خوبی بر روی سطح محیط کشت پخش کنید.

پلیت ها را در انکوباتور قرار دهید

پس از  1هفته شمارش را انجام دهید

 

 

نتایج:

محیط کشت SEA:

10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
13	25	109	202

 

محیط کشت N.A:

10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
51	غیر قابل شمارش	67	179

 

محیط کشت SDA:

10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
1	5	10	31

 

 

محاسبات:

 

 

 

 

Σ=

مجموع تعداد کلنی های شمارش شده در پلیت های ( حداقل تعداد پلیت های هر رقت باید 3 عدد باشد که از میزان خطا کم شود)  مربوط به هر رقتی که شمارش شده است ( فقط پلیت های حاوی 300-30 کلنی شمارش می شوند) ( n1+n2+n3) + (n’1+n’2+n’3) +…

 

N=

 تعداد باکتری ها در یک میلی لیتر CFU / ml

n X 1/ con.3=

  عکس هر رقت×  تعداد پلیت مربوط به هر رقت) فقط رقت هایی که شمارش شده اند )

 

محیط کشت SEA:

202+109=311

2=155/5÷311  میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

N=155/5 ÷(10^-4 +10^-5)=14136363.63

 

محیط کشت N.A:

179+67+51=297

3=99÷297  میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

N=99÷(10^-4 +10^-5+10^-7)=99×8991825.61

 

محیط کشت SDA:

1=31÷ 31میانگین کلونی های هر رقت شمارش شده

N=31÷(10^-4)=3100000