کروماتوگرافی
:تئوری آزمایش
روش ساده اي است براي جدا كردن مواد حل شده در يك حلال ، از اين روش براي شناسايي مواد نيز مي توان استفاده نمود و انواع مختلف دارد كروماتوگرافي كاغذي ، ستوني ، گازي و مايع. در اين روش فاز متحرك مانند آب از فاز ساكن(ثابت) مانند كاغذي يا گچ عبور مي كند و به سمت بالا مي رود. هنگامي كه به لكه رنگين مانند جوهر مي رسد، هر جزء از جوهر را كه جاذبه كمتري با كاغذ (فاز ساكن) دارد كه از جزئي كه جاذبه قوي تري دارد جدا مي كند و با سرعت بيشتري به جاي بالاتر مي برد و بدين ترتيب اجزاي مخلوط از هم جدا مي شوند.
مثال : جدا سازي مواد موجود در يك قطره خون.
همه انواع کروماتو گرافی دارای اجزای زیر هستند:
که مایع و یا گاز می باشد. :(Mobile phase) فاز متحرک
:که می تواند مایع ویاجامد باشد. (Stationary phase) فاز ثابت
به طور کلی فاز متحرک به دلیل جریانی که دارد از کنار یا درون فاز ثابت عبور می کند و بر اساس تمایل اجزای مختلف نمونه مورد نظر باسرعتهای مختلف توسط فاز متحرک شسسته می شوند. اگر ماده مورد آنالیز تمایل کمتری به فاز ثابت داشته باشد در نتیجه سریعتر توسط فاز متحرک شسته می شود و اگر بیشتر به فاز ثابت تمایل داشته باشند باسرعت کمتر شسته می شوند و به این ترتیب مواد از هم تفکیک می شوند.به عبارت دیگر اجزاء مختلف نمونه بر اساس اینکه با چه شدتی توسط فاز ثابت نگهداشته می شوند از هم جدا می گردند.
از انواع كروماتوگرافي ميتوان به موارد زیر اشاره کرد:
1.كروماتوگرافي روي كاغذ
Paper Chromatography (PC)
2.كروماتوگرافي روي لايه نازك
( Thin Layer Chromatography (TLC
3.كروماتوگرافي مایع با کارایی بالا(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
4.كروماتوگرافي گازي Gas Chromatography (GC)
5.کروماتوگرافی ستونی(CC):درکروماتوگرافی ستونی از یک ستون شیشه ای استفاده مشود که درونآنفاز ثابت را قرار میدهند و سپس مواد مورد آزمایش را که در حلال حل نموده اند ازبالا درون ستون میریزند که در این هنگام بر اساس جذب سطحی یا بر اساس اندازه ی مولوکولها از بالا به پایین مواد از همدیگر جدا میشوند.
كروماتوگرافي روي كاغذ: :Paper Chromatography (PC)
در این نوع کروماتو گرافی پس از استخراج ماده مورد آنالیز آن رادر حلال مناسب حل کرده و روی کاغذ لکه گذاری می کنیم. سپس آن را داخل تانک قرار می دهیم که در آن فاز متحرک قرار دارد. به دلیل کشش سطحی حلال روی سطح کاغذ بالا آمده و اجزاء مختلف بر اساس حلالیت و تمایل شان به فاز ثابت در محلهای مختلف باقی می مانند. هرچه اجزاء مخلوط بیشتر در حلال
حل شوند روی سطح کاغذ بیشتر بالا می روند. و به این ترتیب از هم جدا می گردند. در مرحله بعد باید سپس بایستی با معرف مناسب لکه هارا ظاهر و قابل دید نمود.
كروماتوگرافي بر روي لایه نازك(TLC)
این روش ساده ترین و مفید ترین روش تشخیص اولیه و خلوص مواد است. در این روش فاز ثابت روی یک صفحه از جنس پلیمر یا آلومینیوم کشیده می شود .که جنس فاز ثابت ترکیباتی نظیر سیلیکاژل ویا آلومینا می باشد. در این نوع کروماتو گرافی پلاریته اهمیت زیادی دارد.روش کار مانند کروماتو گرافی کاغذ می باشدو بطور خلاصه شامل مراحل ذیل است:
استخراج دارو ویا ماده مورد آنالیز از ادرار بوسيله حلال آلی، تغليظ حاصل استخراج و حل کردن آن در یک حلال آلی ، لکهگذاري روي صفحه TLC، جداسازي تركيبات بوسيله فاز متحرك، ظهور و شناسایی داروهاي تفكيك شده توسط معرفهاي شيميايي شناخته شد، استفاده از RF(نسبت حرکت نمونه مورد آنالیز روی صفحه TLC به حرکت جبهه فاز متحرک)، استفاده از جذب UV يا فلورسانس. توجه به نكاتي مثل خصوصيات فاز متحرك، فاز ثابت، اشباع بودن يا نبودن تانك در جداسازي و شناسايي دارو مؤثر است.
TLC مزايا
ساده ترین و مفید ترین روش تشخیص اولیه و خلوص مواد است. موادي كه به هنگام لكهگذاري بر روي صفحه قرار داده ميشوند، پس از تفکیک شدن بر روي آن باقي مانده و در نهايت در صورت بكارگيری آشکار سازهای مناسب، قابل شناسایی و مشاهده خواهند بود.
كاربرد ساده داشته و نياز به تجهیزات اندك دارد.
قابليت جداسازي و شناسايي مقادير ناچیزمواد را دارا می باشد.
زمان انجام آزمایش كوتاه است.
می توان چندین نمونه را هم زمان آزمایش کرد.
از فازهای ثابت و متحرک متنوع می توان استفاده نمود.
از معرفهای ظاهر کننده متنوع می توان استفاده نمود.
TLC معایب
حساسیت آن کمتر از روشهای GC,GC/MS,HPLC می باشد.
دقت وصحت آن کمتر از روشهای فوق می باشد.
گاز کروماتو گرافی (GC)
در روش گازکروماتو گرافی فاز متحرک گاز است. ماده مورد آنالیز تحت فشار گاز در طول ستون کروماتو گرافی که توسط ذرات فاز ثابت پر شده است، حرکت کرده وبر اساس پلاریته با سرعتهای متفاوتی در طول ستون حرکت می کنند ودر نتیجه با فواصل زمانی مختلفی از انتهای ستون خارج شده و توسط آشکار ساز (Detector)شناسایی می شود.
اين روش از حساسيت و دقت بالایی برخوردار است. روش كلي كار عبارتست از استخراج دارو با يك حلال مناسب، تغليظ حاصل استخراج و تبديل آن به يك مشتق فرار (مشتقسازي)، تزريق به دستگاه گاز كروماتوگراف، عبور فاز متحرك گازي به همراه نمونه مورد آنالیز از ستون و بالاخره، شناسايي و ثبت توسط آشكارساز.
معمولاً به منظور افزایش حساسيت، دقت و صحت دستگاه گاز كروماتوگراف،آن را به طيف سنج جرمي متصل می کنند که به آن (GC/MS) می گویند.این روش ، روش مرجع برای تشخیص بسیاری از دارو ها، مواد مخدرو مواد مورد آنالیز می باشد.
با توجه به اینکه این روشها گران بوده و استفاده از آنها نیاز به تخصص دارد.بعلاوه نیازمند خدمات مناسب بعد از فروش می باشد،لذا مواردی از این قبیل استفاده از این سیستمها رادچار محدودیت میکند. از اینرو از روشهای ساده تر و کاربردی دیگری که در عین حال از حساسیت و دقت مناسب برخوردار باشند (نظیر TLC) استفاده می شود.
2-4-كروماتوگرافي مايع با كارایی بالا (HPLC)
در روش کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا فاز متحرک مایع است. ماده مورد آنالیز تحت فشار پمپ در طول ستون کروماتو گرافی که توسط ذرات فاز ثابت پر شده است حرکت کرده وبر اساس پلاریته با سرعتهای متفاوتی در طول ستون حرکت می کنند در نتیجه با فواصل زمانی مختلفی از انتهای ستون خارج شده و توسط آشکار ساز (Detector)شناسایی می شود. اين روش از حساسيت و دقت بالایی برخوردارمی باشد. روش كلي كار در HPLC شامل مراحل زير است:
استخراج با يك حلال مناسب، تزريق حاصل استخراج به دستگاه و حرکت آن به همراه فاز متحرك مناسب با فشار بالا به داخل ستون ، تفکیک آن و بالاخره تشخیص بوسیله آشکار ساز واندازه گيري تركيبات مورد نظر براساس سطح زير منحني پيكهاي بدست آمده می باشد. امروز توسعه و تجهيز HPLC منجر به ساخت دستگاههاي كاملاً خودكار و منعطف براي سيستمهاي مختلف شده است. اين روش از حساسيت و دقت بالايي برخوردار است.
برای نمونه روش کروماتوگرافی کاغذی را مورد آزمایش قرارمیدهیم.
وسایل و مواد مورد نیاز:
کاغذ کروماتوگرافی/حلال/کبالت/مس/آهن/تانک
روش کار:
یک کاغذ کروماتوگرافی برداشته یک خط افقی با مداد روی آن کشیدیم.و از محلول ها به میزان یک قطره روی آن ریخته و بعد کاغذ را داخل تانک که حاوی 2میلی لیتر آب مقطر,4سی سی
و 16سی سی استات است گذاشتیم تا بالا بیاید و فاز محرک با رنگ خودش را نشان دهد.HCl
محاسبات و نتایج: