2-با افزودن رنگ کیریستال ویوله رقیق یا سبز متیل به نمونه سلول های خونی روی لام چه تغییری ایجاد می شود؟
بعد از افزودن کیریستال ویوله به نمونه سلول های خونی روی لام, گلبول های سفید هم مشاهده شدند.
3-آیا لنفوسیت ها و مونوسیت ها به یک اندازه و یکسان دیده میشوند؟منظره هسته آنها چگونه است؟
مونوسیت ها بزرگتر از لنفوسیت ها هستند.مونوسیت‌ها بزرگترین سلول درجریان خون محسوب می‌شوند.هسته مونوسیت ها لوبیائی، کلیه‌ای یا به شکل مغز است. هسته لنفوسیت ها دایره شکل و گرد است.
4-آیا لنفوسیت ها و مونوسیت ها هر دو یکسان رنگ میشوند؟این سلول ها کدام یک از رنگ اسیدی یا بازی را به خود میگیرند؟ بله-بازی
5-چرا دانه های بازوفیل رنگ کریستال ویوله را به خود میگیرند؟
زیرادارای تاکتیک شیمیایی بالا هستند.هر دو باز هستند پس با هم رنگ میشوند.
6-مونوسیت و لنفوسیت ها کدام سیتوپلاسم کمتری دارد؟
لنفوسیت سیتوپلاسم کمتری دارد.در حالیکه مونوسیت ها, سیتوپلاسم زیاد وآبی روشن دارند.
7-آیا گلبول قرمز یکنواخت رنگ می گیرند؟شدت رنگ در کدام قسمت ها بیشتر است؟چرا؟
خیر-هسته-چون میزان هموگلوبین در هسته بیشتر است.
8-چه تفاوت اساسی بین گلبول های قرمز خون انسان و قورباغه وجود دارد؟
گویچه های سرخ انسان فاقد هسته وسایر اندامک های اصلی یاخته ای هستند و 33درصد حجم آنها را پروتئینی بنام هموگلوبین تشکیل میدهد.در حالیکه گلبول قرمز قورباغه هسته دارند.
آزمایش5
1-چه تفاوت بین سلول های پوششی مژه دار سقف دهان و سلول های ششی در قورباغه وجود دارد؟
دهان:دارای هسته کوچک و سیتوپلاسم زیاد و شکل سلول های آن نامنظم و دایره ای است.فاقد مژک است.
شش: دارای هسته بزرگ و سیتوپلاسم کم و شکل سلول های آن منظم و استوانه ای است.دارای مژه و زنش در مژه میباشد.
2-چرا سلول های پوششی ششی مژه دارند ولی سلول های پوست و یا غضروف مژه ندارند؟
به علت نوع وظیفه خود. سلول ششی در واقع همانند کیسه های هوایی در مهره داران عالی تر است.
آزمایش6
1-چرا در پوست,سلول ها چنین محکم به هم متصل میباشند حال آنکه در دهان به راحتی از هم جدا میشوند؟بافت پوششی دهان سنگفرشی یک لایه است به دلیل تک لایه بودن به راحتی از هم جدا میشوند.و باید سیال باشد.در حالیکه در پوست به صورت چندوجهی و متصل به یکدیگرند این سلول ها به کمک مجموعه های اتصالی به یگدیگر به طور محکم اتصال دارند تا در برابر عوامل خارجی از بدن محافظت کنند.

فاویسم بیماری است که در اثر نقص آنزیم گلوکز ۶ فسفات دهیدروژناز به وجود می آید.کمبود گلوکز ۶ فسفات دهیدروژناز (یک آنزیم وابسته به جنس و محلول در آب) شایعترین بیماری است که باعث نقص آنزیمی می شود.

آنزیم گلوکز ۶ فسفات دهیدروژناز، آنزیم مهمی در شانت هگزوز مونوفسفات است که برای حفظ ذخایر داخل سلولی گلوتاتیون احیا شده لازم است. این آنزیم گلوکز ۶- فسفات را به ۶- فسفوگلوکونیک اسید تبدیل می‌کند و درحین این عمل NADPH تولید می‌شود. گلوتاتیون احیا شده اریتروسیت‌ها را در برابر اکسید شدن غشا و هموگلوبین حفاظت می‌کند.در صورت نبودن گلوتاتیون احیاء شده، مواد اکسیدان باعث رسوب هموگلوبین و تشکیل Heinz bodies می‌شوند و غشای گلبول قرمز آسیب جدی می‌بیند و این دو تغییر باعث از بین رفتن زودرس گلبول‌های قرمز می‌شوند. در مناطق با شیوع بالای مالاریا مالاریا بومی است، کمبود G۶PD شیوع ۵ تا ۲۵ درصد دارد، در حالی که در نواحی غیربومی، شیوع آن کمتر از ۰٫۵ درصد است. ژن مربوطه بر روی کروموزوم ایکس قرار دارد و تقریباً تمام بیماران مرد هستند.بیشتر زنان هتروزیگوت علامت بالینی ندارند ولی گاهی به دلیل قانون لیون (غیر فعال شدن اتفاقی کروموزم X) زنان هتروزیگوت نیز علامت­دار می‌شوند.تخمین زده می شود ۴۰۰ میلیون نفر در کل مبتلا باشند. در آمریکایی از آلل ه(گونه ا) به میزان ۱ نفر در هر ۲۰ نفر مردان سیاه پوست یافت شده است.با توجه به ۳۰۰ گونه توصیف شده چنین به نظر می رسدکه کمبود آنزیم گلوکز6فسفات دهیدروژناز ناهمگون ترین اختلال ژنتیکی باشد که تاکنون  تشخیص داده شده است .به نظر می رسد شیوع بالای ژن گونه های مختلف آنزیم گلوکز6فسفات دهیدروژناز در بعضی از جمعیت ها ناشی از این حقیقت باشد که کمبود این آنزیم همانند هموگلوبین سلول داسی شکل و تالاسمی تا حدی باعث محافظت در برابر مالاریا می گردد. در ابتدا این اختلال آنزیمی وقتی مورد توجه قرار گرفت که دیده شد داروی ضد مالاریا در مردان سیاه پوست (مشخص شد مبتلا به کمبود G6PD هستند) ایجاد آنمی همولیتیک می کند.مکانیزم این آنمی همولیتیک  ناشی از دارو به طور قابلکه بعدا قبولی مشخص است.یکی از محصولات G6PD یعنی NADPH عمده ترین منبع اکی والان های احیا کننده در گلبول قرمز است.NADPH این سلول را بوسیله تولید مجدد گلوتاتیون احیا شده از شکل اکسیده آن در مقابل آسیب اکسیداتیو محافظت می کند.در کمبود G6PD داروهای اکسید کننده مانند پریماکین باعث تهی شده سلول از گلوتاتیون احیا شده و تخریب اکسیداتیو پس از آن باعث همولیز می گردد.ترکیبات مضر دیگر شامل آنتی بیوتیک های سولفونامیدی ,سولفونها مثل dapsone (که در درمان جذام و عفونت پنوموسیتیس کارینی به مقدار زیادی مصرف می شود),نفتالین (ضد بید) و چند داروی دیگر می باشند.نقش بعضی از دروهای دیگر در ایجاد همولیز در کمبود G6PD نامشخص است چرا که اهمیت فاکتورهای دیگری در این مورد نامشخص می باشد,این فاکتورها عبارتند از فاکتورهای ژنتیکی مثل تفاوت های نژادی و فردی در فارماکوکینتیک ناشی از مقیاس های ژنتیکی و معیارهای غیر ژنتیک (مثل عفونت که خود می تواند در انواع شدید کمبود G6PD ایجاد همولیز کند).فاویسم یک آنمی همولیتیک شدید ناشی از خردن باقلا است که از زمان های گذشته در قسمت هایی از منطقه مدیترانه شناخته شده بوده است علت این بیماری کمبود شدید G6PD می باشد.این نقص آنزیمی سلول ها را مستعد اثر مواد اکسید کننده موجود در باقلا می کند.در مناطقی که گونه های شدید این بیماری مثل آلل مدیترانه ای شایع هستند,یکی از علل عمده ی یرقان نوزادان (Neonatal  jaundice ) و آنمی همولیتیک غیر اسفرولیتیک مادرزادی این بیماری است.آلل های غیر طبیعی شایع در سیاهان آمریکا و ناحیه مدیترانه در الکتروفورز با سرعتی مشابه سرعت گونه ها A  و B حرکت می کنند ,ولی دارای فعالیت کمتری می باشند و به همین علت به ترتیب Aˉ و Bˉ نامیده شده اند.گرچه کمبود G6PD ر مردان سیاه شایع تر است ولی تعداد محسوسی از زنان سیاه پوست آمریکایی (حداقل ۱ در ۴۰۰ ) از نظر ژنتیکی Aˊ \Aˉ بوده و از نظر بالینی مستعد همولیز ناشی از داروها می باشند.در گونه Aˉ علاوه بر کاهش فعالیت کاتالیتیک ناپایداری آن نیز از فاکتورهای عمده در ایجاد پاسخ پاتولوژیک به خوردن دارو است.ساخت پروتئین Aˉ بوسیله جهش بی تغییر می ماند,اما به علت اینکه این مولکول نسبتا پایدار است با پیر شدن گلبول قرمز میزان آن بسیار سریعتر از حالت طبیعی کاهش می یابد.پس از خوردن دارو بیماران دارای این آلل تنها در زمان لازم برای تخریب آن قسمت از گلبول های قرمز پیر که به علت مسن شدن مقدار قابل توجهی از فعالیت G6PD را از دست داده اند,دچار همولیز می شوند (معمولا حدود یک هفته ) حتی در صورت ادامه یافتن داروی قبلی مرحله همولیتیک به انتها می رسد چرا که سلول های جدیدی در پاسخ به همولیز تولید شده اند بمیزان کافی حاوی G6PD جهت ممانعت از تخریب اکسیداتیو می باشند.

علائم بالینی فاویسم:

رنگ پریدگی,تغییر در رنگ ادرار,تهوع و استفراغ,بی حالی و گاهی کاهش سطح هوشیاری,شوک,اسکلرای ایکتریک,تاکیکاردی,تاکی پنه,افت فشار خون,نارسایی حاد کلیه در موارد پیشرفته

بیماری گلبول های قرمز پیر را بیشتر از سلول های جوان مبتلا می کند.زیرا میزان این آنزیم در گلبول های قرمز جوان و رتیکلوسیت ها بیشتر است.

نشانه های آزمایشگاهی:

آنمی,ایکنر,رتیکولوسیتوز,دیدن Heinz body ,کومبس مستقیم منفی,هموگلویبنوری,Bite cell

برخی مواقع بیماران نقص فعالیت آنزیمی را در تست های رایج آزمایشگاهی در زمان همولیز نشان نمی دهند چون در گلبول های قرمز جوان میزان این آنزیم بالاست و ممکن است در موقع حمله حاد که گلبول های قرمز جوان وارد جریان خون می شوند فعالیت آنزیمی طبیعی گزارش شود.در این گونه بیماران پس از سپری شدن یک نیمه گلبول های قرمز (۲ تا ۳ ماه بعد) تکرار می شود.

تشخیص:

تشخیص با اندازه گیری سطح آنزیم G6PD در گلبول های قرمز است با انجام آزمایش های PBS / Retic.count /Bill /U / A /

CBC(Hb,Hct)

درمان:

این بیماری درمان قطعی ندارد و تنها اقدام موثر پیشگیری از بروز حمله همولیز با پرهیز از مواجهه با مواد اکسیدان و در صورت بروز حمله مراجعه سریع به پزشک جهت اقدامات نگهدارنده و حمایتی جهت پیشگیری از عوارض همولیز است.فردی که دچار همولیز می شود پس از تخریب گلبول های قرمز خونش ,گلبول های قرمز جوان وارد گردش خونش می شوند که همین پدیده جوان شدن گلبول های قرمز خون بیماری را تا حدی کنترل می کند و افراد بستری در بیمارستان بیشتر از نظر میزان آب و نمک مورد کنترل قرار می گیرند و در صورت نیاز به آنها خون تزریق می شود.

نحوه توارث:

یک بیماری وابسته به ایکس و مغلوب است به همین دلیل این بیماری در پسرها شایع تر است چون پسره فقط دارای یک کروموزم ایکس و دختران دارای ۲ تا از این کروموزوم هستند بنابراین اگر ژن آنزیم نام برده شده نقص داشته باشد پسران بیشتر گرفتار می شوند.اگر دو کروموزوم ایکس دختران گرفتار نقص این ژن باشد یا اگر کروموزوم ایکس سالمشان نتواند دختر را در مقابل ایکس معیوب سالم نگه دارد دختران هم به این بیماری مبتلا می شوند ولی تعداد مبتلایان پسر خیلی بیشتر است.تمامی دختران یک پدر مبتلا حامل هستند اما تمام پسران این پدر غیر مبتلا خواهند بود.احتمال آنکه دختران حامل علائم بالینی داشته باشند پایین می باشد زیرا غیر فعال شدن کروموزوم ایکس (قانون لیون) به میزان کافی ناشایع می باشد.

** یک بیماری وابسته به ایکس و مغلوب می‌باشد به همین دلیل:

1. پسران یک مادر حامل نوعی جهش آنزیم گلوکز ۶- فسفات دهیدروژناز، به احتمال ۵۰ درصد مبتلا می‌باشد.
2. دختران به احتمال ۵۰ درصد حامل هستند.
3. تمامی دختران یک پدر مبتلا، حامل هستند، اما تمام پسران این پدر غیر مبتلا خواهند بود.احتمال آن‌که دختران حامل علایم با اهمیت بالینی داشته باشند پایین می‌باشد، زیرا غیر فعال شدن کروموزوم x (قانون لیون)به میزان کافی، ناشایع می‌باشد. **

عواملی که در مبتلایان به کمبود آنزیم G6PD همولیز ایجاد می کند:

باقلا به هر شکل موجود

آنالوگ های ویتامین K

داروهای ضد مالاریا:کلرولین , پریماکین,پاماکین,کیناکرین,کینین

سولفونامیدها:کوتریموکسازول(تری متوپریم- سولفومتوکسازول),نالیدیکسیک اسید (نگرام),سولفاستامید,سولفادیازین,سولفی سوکسازول

ترکیبات نیتروفوران:فورکسون ,فورورانتین ,فورابن,نیتروفورانتیوئین,فورازولیدون,نیتروفورازون (فوراسین),سپتاپرین

داروهای متفرقه: متیلن بلو,پروبنسید,استیل سالیسیلیک اسید,فنازوپریدین,فنیل هیدرازین,بنزن نفتالین,ایزونیازید,آسپرین,آنتی پیرتیک ها,بلودو متیلن,استامینوفن

آنتی بیوگرام (آزمايش هاي حساسيت دارويي )

اریترومایسن ، پنی سیلین ، سولفونامید ، تتراسایکلین ، ونکومایسین و .... جز دسته ای بزرگ از ترکیبات شیمیایی هستند که باعث متوقف کردن رشد باکتریها (باکتریواستاتیک) و یا از بین بردن باکتری ها (باکتریوسیدال) در یک دوز پایین می شوند . در علم میکروب شناسی به این دسته از دارو ها که بروی باکتری ها اثر می گذارند آنتی بیوتیک می گویند . هر دسته از انتی بوتیک ها بر روی باکتری خاصی تاثیر دارد و این دارو ها بر روی ویروس و یا سایر میکروارگانیسم ها تاثیری نخواهند داشت . با این حرفا ،  این سوال در ذهن ایجاد می شود که ما از کجا بدانیم چه آنتی بیوتیکی بر روی چه باکتری هایی موثر است ؟ جواب سوال ما تست آنتی بیوگرام است که به صورت روتین در آزمایشگاه های میکروبیولوژِی انجام می گیرد . این تست به ما نشان می دهد که کدام یک از آنتی بیوتیک ها بر روی میکروب ما موثر است . همانطور که می دانید نمونه های گرفته شده برای بخش میکروبیولوژِی متفاوت هستند . اما نمونه ها هر چی که باشند (خون ، مایع مغزی-نخائی ، مدفوع ، ادرار ، خلط و..) در آخر  معمولا آنتی بیوگرام می شوند تا داروی موثر تجویز شود . در واقع باید بگوئیم که در عفونت های میکروبی آزمایشگاه دارو را تجویز می کند نه پزشک ... در این پست تقریبا هیچ نکته ای را قلم ننداختم و فکر کنم کامل است . منتظر نظرات شما هستم .

 خلاصه ای از پروسه آنتی بیوگرام دیسک دیفیوژن

بعد از کشت نمونه دریافتی در محیط کشت مناسب ، اگر شرایط مناسب باشد و باکتری در نمونه ما باشد ، باکتری موجود در نمونه رشد خواهد کرد . بعد از رشد باکتری ، از ان لام (مقداری نمونه + سرم فیزیولوژِی) تهیه می کنیم و رنگ آمیزی گرم انجام می دهیم . اگر باکتری ایزوله ما ، جز باکتری های پاتوژن باشد ، باید تست آنتی بیوگرام را انجام دهیم . مقداری از نمونه را برداشته و  در محیط کشت آنتی بیوگرام کشت می دهیم ، سپس دیسک های آنتی بیوگرامی را روی محیط کشت گذاشته و جواب را بعد از ۲۴ ساعت برسی کرده و نتایج را گزارش می کنیم .

·         بعد از معرفی ابتدایی آنتی بیوگرام ، وارد بحث تخصصی آزمایشگاهی می شویم .

اصول آنتی بیوگرام

اصول آنتی بیوگرام بر پایه دو اصطلاح میکروب شناسی است یعنی :

·         Minimum Inihibitory Concentration (MIC)

·         Minimum Bactericidal Concentration (MBC )

منظور از MIC ، غلظتي از يك آنتي بيوتيك است كه مي تواند رشد باكتري را در شرايط آزمايشگاهي مهار كند. و منظور از MBC ، حداقل غلظتي از دارو است كه باكتري را از بين مي برد. در اغاز باید بگم که باید آزمایش کننده چهار اصل زیر را قبل از آغاز آنتی بیوگرام مشخص کند :

·         Which organisms to test?_{کدام ارگانیسم برای تست}                                                        

·          

·         What methods to use?_{کدام روش تست}                                                               

·          

·         What antibiotics to test?_{کدام آنتی بوتیک}  

·          

·         How to report results? _{چگونگی گزارش نتایج}

روش های مختلف انجام تست تعیین حساسیت داروئی

·         Disk diffusion (Kirby Bauer)

·         Broth micro-dilution MIC (NCCLS متد رفرنس)

·         Etest

وسائل و موارد مورد نیاز برای تست انتی بیوگرام "دیسک دیفیوژن"

1.        محیط کشت که آنتی بیوگرام بر روی آن انجام می شود که "آگار مولر هینتون" می باشد .

2.        لوله حاوی نیم مک فارلند .

3.        لوله حاوی یک سی سی سرم فیزیولوژِی استریل

4.        دیسک های انتی بیوگرام

5.        باکتری خالص در محیط کشت مناسب

6.        سواب ، انس ، شعله ، هود ، چراغ

·         محیط نیم مک فارلند

محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با ان مقایسه می کنیم . این محیط حاوی ۱.۵*۱۰^۸ باکتری است . نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است :

این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظرف در بسته که به وسیله اتش بسته شده است می تواند مورد استفاده قرار گیرد . اما با این اوصاف ، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد ، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود . زمانی که می خواهیم از این محیط استفاده کنیم باید انرا به خوبی حل بزنیم و جهت مقايسه كدورت لوله كشت با لوله مك فارلند، استفاده از يك زمينه سفيد با خطوط سياه و نور كافي توصيه مي‌شود این اقدام بويژه جهت باكتريهايي مثل هموفيلوس، گنوكك و پنوموكك كه در محيط آبگوشت به خوبي رشد نمي‌كنند توصيه مي‌شود.

·         روش کار

روش های مختلفی برای تعیین حساسیت باکتری ها به انتی بیوتیک ها وجود دارد اما من در این قسمت تست روتین و ساده دیسک دیفیوژن (Disk diffusion ) را معرفی می کنم .

بعد از ایزوله کردن باکتری ، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم . باید در نظر داشت که چون ، در تست آنتی بیوگرام میزان کدر بودن برای ما خیلی مهم است ، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کنیم تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداریم . اگر میزان کدورت کمتر از نیم مکفارلند باشد ، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم و یا اگر میزان کدر بودن ، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند برسیم . بعد از تهیه محلول هموژن خود ، با سواب استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواب ، (برای آب کشی ، سواب را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود .) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال می دهیم و به طور کامل به وسیله سواب ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت می دهیم به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد  . بعد از کشت ، دیسک های انتی بیوگرام که قبل از نیم ساعت از تست ، بیرون یخچال قرار داده شده اند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال می دهیم . باید ذکر کنم که نحوه قرار دادن دیسک ها در محیط کشت مولر هینتون ، به صورت دایره ای  است و فاصله این دیسک ها از هم دیگر حدود 12 میلیمتر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند . در ضمن فاصله این دیسک ها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کنیم . دیسک های مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی ، پنی سیلین قرار نمی دهیم چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتی بیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمی دهیم چون این انتی بیوتیک نمی تواند وارد مجاری ادراری شود و... بعد از قرار دادن دیسک ها ، در پلیت را بسته و به مدت 24 ساعت آنها را در دمای 37 درجه سانتیگراد ، انکوبه می کنیم (لازم به ذکر است که بنابه به تحقیقات تازه محقین ، دمای انکوبه برای آنتی بیوگرام به ۳۵ درجه کاهش یافته است و مدت زمان آن هم به ۱۶ تا ۱۸ ساعت کاهش یافته است ) . بعد از 24 ساعت پلیت را زیر چراغ برسی می کنیم  .آنگاه مي‌بايد قطر هاله عدم رشد را با خط‌كش اندازه گيري کرد و با توجه به جدول همراه دیسک ها ، گزارش تست انتی بیوگرام خود را برای هر یک از انتی بیوتیک ها ، به صورت حساس (Susceptible ) ، مقاوم (Resistant) و یا نیمه حساس (Intermediate) گزارش می شود .

نحوه خواندن و گزارش کردن

بعد از انکوبه ، محیط ما باید به صورت زیر باشد :

همان طور که مشاهده می کنید در اطراف برخی از دیسک ها هاله روش وجود دارد که این نشان دهنده حساس بودن ان بکتری به ان دیسک است و باید حساس گزارش شود . همچنین در اطراف بعضی از دیسکها هیچ گونه هاله ای نیست در این حالت این باکتری را باید نسبت به ان دیسک مقاوم گزارش داد . اگر طبق جدول خود هیچ یک از حالات فوق مشاهده نشود در اینصورت نیمه حساس را گزارش می کنیم .

و چند نکته مهم  :

·         در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده کنید .

·         همیشه امتداد خط کش باید از وسط دیسک عبور کند .

·         همیشه قطر اندازه گیری می شود .

·         باید در تست انتی بیوگرام ، نگاه بدبینانه ای داشت . یعنی اینکه کوتاهترین مسیر را برای تعیین حساسیت انتخاب می کنیم .

·         اگر در اطراف دیسک خط هایی کشیده شده باشد در این صورت باید از اخرین خطی که بعد از ان دیگر کلونی نیست تعیین حساسیت کرد.

·         اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم باشد باید از همان جا تا دیسک را اندازه گیری کرد نه کل هاله را .

·         همیشه به محل هاله دقت کنید بازم می گم همیشه و کوتاهترین مسیر ار انتخا کنید .

·         دیسک ها و هاله ها را در زیر نور برسی کنید .

 محيط كشت در آنتي بيوگرام

محيط مورد استفاده در روش دیسکی مولرهينتون است كه بايد pH آن بين 4/7-2/7 تنظیم شده باشد .

و در پليت به قطر 100 ميلي متر حدود 30-25 ميلي ليتر محيط مولر هینتون میریزیم و قطر مورد نظر حاصل مي‌گردد. جهت اجتناب از خشك شدن سطح محيط بايد پليتها را در كيسه‌هاي پلاستيكي نگهداري نمود.پس از تلقيح محيط آنتي بيوگرام در فاصله حداكثر 15 دقيقه مي‌بايد ديسكهاي آنتي بيوتيك را در سطح آگار با فاصله مناسب از يكديگر  قرار داد.سپس به مدت 18-16 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گرام نگهداري نمود. روشهای اصلاح شده در باکتریهای سخت رشد نیز یکی دیگر از روش ها است در بعضی از باکتریهای سخت رشد از محیط های کشت اختصاصی استفاده می شود مانند : محیط کشت HTM در هموفیلوس ها .

نکات بسیار مهم در آنتی بیوگرام

·         تست همیشه در زیر هود و در کنار شعله انجام شود .

·         باکتری ایزوله شده باید ، خالص رشد کرده باشد .

·         در زمان برداشت نمونه باید سعی شود که از یک کلونی برداشت شود .

·         قبل از انتقال سواب به محیط کشت مولر هینتون ، محیط کشت را از عدم رشد کلونی های باکتری در محیط کشت مولر هینتون برسی کنیم . اگر کلونی در محیط کشت دیده شد ، محیط را عوض می کنیم .

·         همیشه به وسیله انس نموه را برداشته و سپس به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل اضافه کنید .

·         برای اینکه به کدروت مورد نظر نیم مک فارلند دست یابید ، از مقادیر کم کلنی شروع کنید و یا کلونی را ابتدا به دیواره لوله انتقال دهید و سپس کم کم کلونی را به محیط آبگوشت اضافه کنید تا به کدورت مورد نظر دست یابید .

·         همیشه بعد از باز کردن در لوله و بعد از بستن ان ، سر لوله را در معرض شعله قرار دهید .

·         اگر پنبه سر لوله ها ، به سطح هود افتاد باید آنها را دور انداخت .

·         اگر سوآب را به خوبی آب گیری نکنیم در این صورت به علت تبخیر مایع بالایی در انکوباسیون ممکن است رطوبت در سر طرف مولر هینتون قرار گیرید .

·         همیشه بعد از اینکه محیط کشت را با سواب کشت چمنی دادیم ، سواب را به ظرف حاوی مواد ضد عفونی یا استریل کننده انتقال دهیم .

·         اگر نمونه مورد نظر ما مشکوک به سودوموناس است (بوی شبیه گل یاس) در این صورت سواب را ایتدا در روی ضعله قرار دهید و سپس به محیط ضد عفونی کننده انتقال دهید .

·         هیچ وقت سواب را به دور محیط کشت حرکت ندهید .

·         همیشه قبل از باز کردن محیط کشت ، سر پلیت را با ضعله ضد عفونی کنید .

·         برای راحتی کار ، ایتدا دیسک ها را بر روی پلیت تعیین مکان کنید و سپس به محیط اضافه کنید .

·         تا زمانی که دیسک ها را در روی محیط مولر هینتون ، فشار نداده اید می توانید جای انها را تغییر دهید . اما بعد از فشار هیچ وقت نباید آنها را تغییر داد .

·         همیشه دیسک ها را از بالا توسط یک گیره به محیط اضافه کنید .

·         فبل از گذاشتن دیسک سعی شود که هر دو طرف را برسی کنید تا اگر دیسک حاوی نام نباشد ، از به کار گیری ان خودداری کنید .

خطا های تست انتی بیوگرام

·         اگر بیشتر از یک کلونی برداشت شود ، نتیجه تست ما کلا اشتباه خواهد بود . چون در این صورت با تست آنتی بیوگرام ، چند کلونی را از نظر حساسیت برسی کردیم که ممکن است یک کلنی حساس باشد و دیگری نه . پس دقت شود .

·         اگر محیط کشت ما بعد از انکوبه ، به صورت خط خطی باشد نشان دهنده این است که مقدار کلونی ماکمتر از نیم مک فارلند بود .

·         اگر در دور تمام دیسک ها هاله تشکیل شد و یا در اطراف هیچ یک از دیسک ها هاله ای تشکیل نشد برای برسی نتایج باید تست را تجدید کرد .

·         اگر PH محیط مولر هینتون مناسب نباشد نتایج ما اشتباه خواهد بود .

·         نگه داری غلط دیسک ها و استفاده از محیط های تاریخ گذشته موجب خطا می شود .

·         تهیه اشتباه محیط نیم مک فارلند هم میتواند باعث اشتباه شود .

·         تأخير زياد بين استاندارد كردن كدورت كشت و تلقيح پليت

·           همراه بودن سواب با مقدار زيادي مايع آبگوشت به هنگام تلقيح محيط آنتي بيوگرام (نگرفتن مايع اضافي با جدار لوله)

این نکته ها یادم بود اگه بازم یادم اومد اضافه می کنم

·         دیسک های مورد استفاده در آنتی بیوگرام

همان طور که در بالا هم گفتم ، باید از دیسک های مناسب باکتری ایزوله شده استفاده کرد . انتخاب نوع دیسک ها بسیار مهم است چون از یک طرف باید قضیه مقاوت داروئی را در نظر بگیریم و از طرف دیگر باید سلامت فرد را هم در نظر بگیریم برای نمونه :

بسیاری از باکتری ها کم کم به آنتی بیوتیک ها مخلفت مقاوم می شوند که این می تواند عمر آنتی بوتیک ها را کم کم به سوی افول هدایت کند .

و یا اینکه مصرف خود سر و یا اضافی که حاصل اشتباه فردی و یا اشتباه تکنیکی در تست انتی بیوگرام است می تواند عوارض گوناگونی داشته باشد . مثلا استفاده زیاد از سولفونامید ها باعث بیماری های عصب شنوایی و یا بیماری های کلیوی خواهد شد و یا اینکه مصرف زیاد پنی سیلین باعث تروبوسایتوپنی و مصرف زیاد تتراسایکلین باعث گرانولوسیتوپنی خواهد شد .

·         نگهداری دیسک ها : دیسک ها باید در یخچال و یا در فریز نگه داری شوند . اگر دیسک ها به صورت STOCK هستند در دمای فریز باید نگه داری شوند اما دیسک ها به صورت روتین تا یک ماه در دمای یخچال نگه داری می شوند .

·         کنترل کیفی :  به كمك سوشهاي استاندارد و با مراجعه به جدول مربوطه مي‌بايست نسبت به كنترل كيفي روند آنتي بيوگرام اقدام نمود.

چند نکته :

اگر باکتری ایزوله شده کوکسی گرم مثبت مانند استافیلوکوک طلائی (اورئوس) باشد در این صورت دو دیسک کلیندامایسن و اریترومایسن را در کنار هم و مقداری نزدیک تر قرار می دهیم . چون کلیندمایسن باعث می شود تا ژن القا کننده در اریترومایسن فعال شود . در واقع دیسک کلیندمایسن فعال کننده ژن خاموش اریترومایسن است .

·         آمینوگلیکوزید ها بر روی باکتری های بی هوازی تاثیر می گذارند .

·         کلروامفینیکل در نمونه ادراری استفاده نمی شود چون وارد ادرار نمی شود .

·         ونکومایسن ، اریترومایسن ، کلیندمایسن ، پنی سیلین و چند تا دیگه بر روی باکتری های گرم مثبت تاثیر می ذارند .

·          دیسک ایمیپنم هم برروی گرم مثبت و هم بر روی گرم منفی تاثیر دارد ولی باید در عفونت های شدیدی استفاده شد تا مقاومت ایجاد نشود .

·         سفالکسین که بر روی گرم مثبت و منفی تاثیر دارد به صورت خوراکی است .

·         تتراسایکلین آنتی بوتیک وسیع الطیفی است و معمولا به صورت موضعی استفاده می شود .

در اخر هم باید ذکر کنم که دیسک ها را بر اساس نوع بیمارستان و یا نوع محل تست می توان تغییر داد و یا مکان و فاصله انها را هم تغییر داد و این که بسیاری از مراحل تست به صورت عالی انجام گیرند باید تجربه کافی داشت و همیشه سعی کنید که به بهترین نحو کار خود را انجام دهید .

***کلونی باکتری چیست؟ میکروب چیست؟به جانداران ذره بینی که فقط با میکروسکوپ دیده می شوند میکروب می گویند.

2. کلونی چیست؟اجتماع میکروبها را کلونی می گویند.

***استافیلوکوکوس اورئوس (به انگلیسی: Staphylococcus aureus) یک کوکسی گرم مثبت است. این باکتری در پوست بدن نیز دیده می‌شود. یکی از مهم‌ترین باکتری‌های آلوده کننده مواد غذایی می‌باشد. توکسین این باکتری باعث سرگیجه، اسهال و استفراغ می‌شود.این باکتری از مهمترین استافیلوکوک‌ها می‌باشد.

استافیلوکوکوس(به انگلیسی: Staphylococcus) (در زبان یونانیبه معنای خوشه انگور می‌باشد) به طور عام نام گروهی از باکتری‌ها است که در زیر میکروسکوپ به صورت گرد (کوکسی) بوده و کنار همدیگر و به شکل خوشه انگور قرار گرفته‌اند.

استافیلوکوک‌ها سی و سه زیرگونه دارند. آنها اکثرا بی خطرند و به صورت طبیعی روی پوست اکثر افراد وجود دارند و در خاک نیز زندگی می‌کنند اما گونه‌های بیماریزا نیز در بین استافیلوکوک‌ها وجود دارند که می‌توانند مسمومیت غذایی و استفراغایجاد کنند و یا گاهی عفونت‌های خطرناک منجر به مرگ، همچون ذات‌الریه بدهند.

از شایع‌ترین زیر گونه‌های استافیلوکوک می‌توان گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس(به انگلیسی: Staphylococcus aureus) و گونه استافیلوکوکوس اپیدرمیدس(به انگلیسی: Staphylococcus epidermidis) را نام برد.

گاهی اوقات عفونت‌های استافیلوکوکی به‌ویژه انواعی که در بیماران بستری در بیمارستان رخ می‌دهند به اکثر آنتی بیوتیک‌های موجود مقاوم هستند و بسیار خطرناک می‌شوند که به این نوع از استافیلوکوک‌ها، استافیلوکک مقاوم MRSA می‌گویند.

***اشریشیا کُلای که به «ای‌ کُلای‌» یا کُلای باسیل نیز معروف است، یک باکتری گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه که در سال ۱۸۵۵ کشف شد. این باکتری بیهوازی اختیاری و بدون اسپور می‌باشد. باکتری های اشیرشیا کلای‌، اغلب متحرک می‌باشند. کلای باسیل قادر به تخمیر گلوکز وتولید گاز است وهمچنین لاکتوز راتخمیر می‌کند و اوره‌آز منفی است.

باکتری اشریشیا کولای که در روده جانداران خونگرم (منجمله انسان) زندگی می‌کند؛ از گلوکز تغذیه می‌کند و در غیاب گلوکز از لاکتوز هم به عنوان منبع انرژی استفاده می‌کند. بعنوان مثال، وقتی یک محصول لبنی می‌خوریم، دی ساکارید لاکتوز در دسترس باکتری ای کُلای قرار می‌گیرد. در این هنگام با ساختن آنزیم‌های لازم که برای جذب و تجزیه لاکتوز هستند از این قند به عنوان منبع انرژی استفاده می‌شود.

ویژگی‌های مهم این باکتری

• بطور طبیعی در ساخت ویتامین K2 و همچنین جلوگیری از رشد میکروبهای مضر در روده انسان موثر است.
• برخی از انواع آن، بزرگترین عامل عفونت‌های ادراری است.(حدود ۸۵٪)
• دومین باکتری از لحاظ فراوانی در روده است.(بعد ازباکتروئیدس)
• شاخص آلودگی آب شهری به فاضلاب است.

فلور روده

اشریشیا کُلای معمولاً جزء فلور نرمال روده می‌باشد و در در روده بزرگ انسان به فراوانی یافت می‌شود. ای کلای بطور طبیعی در ساخت ویتامین K2 و جلوگیری از رشد میکروبهای خطرناک دیگر در روده انسان نقش دارد

بیماریزایی

اغلب تیپهای این باکتری در روده بیماریزا نیستند ولی برخی از تیپهای آن مانند تیپهای (Enterotoxigenic E. coli (ETEC با تولید سم و تیپهای (Enteropathogenic E. coli (EPEC با آسیب مستقیم و تیپهای (Enteroinvasive E. coli (EIEC) با تهاجم بافتی می‌توانند ایجاد اسهال بنمایند . اسهال اغلب خفیف است ولی در تیپهای مهاجم تر مانند (EHEC) می‌تواند خونی باشد. مهمترین عامل اسهال مسافران اشرشیاکلی (به خصوص تیپهای (ETEC) می‌باشد . البته باکتریهایی مانند شیگلا و کامپیلو باکتر نیز می‌توانند عامل اسهال مسافران باشند . درکودکان زیردوسال ایزوله کردن آن ازمدفوع ارزش تشخیصی دارد. اسهال مسافران اغلب نیازی به درمان آنتی بیوتیکی ندارد و فقط باید اتلاف آب و الکترولیت را جبران نمود وکمتر از یک هفته بهبود می‌یابد. ولی در موارد شدید از کینولونها مانند سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید می‌توان استفاده کرد. گونه‌های اشریشیا کلی در خارج از روده مثلا در مجاری ادراری، ملتحمه و ... نیز می‌توانند بیماری‌زا باشند.^[۴]

کاربرد در ژنتیک

اشریشیاکلای نخستین جانداری که باروش‌های مهندسی ژنتیک مورد دست ورزی ژن قرار گرفت، در DNA حلقوی این باکتری باز گوانین (G) بیشتر از سایر بازها حضور دارد.

نحوه استفاده از اشریشیا کلی در ژنتیک مولکولی

تعداد باکتری‌های اشریشیا کلی حاوی  پلاسمید مورد آزمایش در اثر تکثیر باکتریایی زیاد می‌شود و در نتیجه تعداد پلاسمیدهای کپی‌شده در باکتری‌ها نیز افزایش می‌یابد به این دلیل در ژنتیک مولکولی از این نوع باکتری بسیار استفاده می‌شود. برای این منظور با استفاده از روش همتاسازی مولکولی سکانس موردنظر را وارد پلاسمید می‌کنند و سپس پلاسمید مورد نظر را با روش شوک گرمایی وارد باکتری‌های اشریشیا کلی می‌کنند. پس از تکثیر این باکتری‌ها روی پلاک حاوی آنتی‌بیوتیک و ال.ب. (L-Broth) و قرار دادن پلاک حاوی باکتری در ۳۷ درجه سانتیگراد (معمولا حداقل به مدت ۱۲ ساعت) با استفاده از روش‌های miniprep, midiprep, maxiprep (بستگی به مقدار دی‌ان‌ای مورد نیاز برای آزمایش دارد) دی‌ان‌ای موجود در باکتری اشریشیا کلی را از آن خارج می‌کنند و سپس از آن در انتقال به داخل سلول‌ها (transfection) و ... استفاده می‌شود.

میکروسکوپی را که در اختیار دارید را بررسی کنید و قسمت های مختلف ذکر شده را تشخیص دهید و به سوالات پاسخ دهید.

الف:بزرگنمایی عدسی چشمی=۱۰

ب:بزرگنمایی عدسی های شیئی:

رنگ نوار عدسی                          بزرگنمایی

قرمز                                             4

زرد                                             10

آبی                                              40

سفید                                            100

ج:بزرگنمایی به دست آمده بدنبال استفاده ترکیبی عدسی های چشمی و شیئی

عدسی شیئی = بزرگنمایی نهایی   Xعدسی چشمی

  10X4=40 

10X10=100

10X40=400

10X100=1000

د:موقعیت دیافراگم و عدسی کندانسور و چگونگی تنظیم آنها را یادداشت کنید.

ابتدا دیافراگم قرار دارد و بابلای آن عدسی کندانسور واقع است(زیر پلاتین).

دیافراگم: دیافراگم وسیله ی تنظیم شدت نور میکروسکوپ است.هر میکروسکوپ به طور معمول دارای دیافراگم زمینه ,دیافراگم کندانسور و دیافراگم اکولر است.دیافراگم:شدت نوری که از منبع روشنایی به کندانسور می رسد را تنظیم می کند و معمولا در بالای منبع نور قرار دارد.و با یک پیچ یا تیغه باز و بسته می شود.

کندانسور از مجمو عه ای از عدسی های محدب یا محدب الطرفین تشکیل شده است که عمل آنها همگرا کردن پرتو های نوری حاصل از منبع روشنایی و تابیدن آنها بر روی جسم است تا نور کافی برای مشاهده جسم فراهم شود و زیر پلاتین قرار دارد و با یک پیچ تنظیم می شود.

ه:پیچ های ماکرو و میکرو بر روی میکروسکوپ شما در چه موقعیتی قرار دارند؟کدام حرکتی کند و کدام حرکتی تند دارد؟هر کدام به چه منظوری استفاده می شوند؟

پیچ های تنظیم بر روی دسته میکروسکوپ در سمت راست قرار دارند که شامل پیچ میزان سریع یا ماکرومتر و پیچ میزان دقیق یا میکرومتر است .این پیچ ها معمولا صفحه پلاتین را در جهتبالا و پایین و بالعکس جا به جا می کنند.با پیچ بزرگ,لوله میکروسکوپ یا پلاتین با سرعت بیشتری بلا و پایین برده می شود.بر روی پیچ ها درجه بندی وجود ارد که به کمک آنها می توان میزان جا به جایی لوله میکروسکوپ یا صفحه پلاتین را مشخص کرد.

سوالات مروری:

1-با باز و بسته کردن دیافراگم چه تغییری در شدت نور ایجاد می شود؟

انطباق صفحات نازک هم با باز وبسته شدن سوراخ میانی آنها و عبور نور بیشتری همراه است.گسترش صفحات نازک موجب تنگ شدن سوراخ میانی و عبور نور کمتری خواهد بود.

2-با جابجایی کندانسور چه تغییری در شدت نور ایجاد می شود؟

 با جابجایی کندانسور شدت نوری که از کندانسور گذشته و به جسم می رسد را تنظیم می کند.برای بیشترین استفاده عدسی کندانسور باید تا حد نهایی زیر صفحه پلاتین میکروسکوپ را بالا بیاوریم.

3-چرا پس از اتمام کار با میکروسکوپ و در زمان جابجایی آن عدسی شیئی 4 در موقعیت مشاهده قرار می گیرد؟

به عدسی ها صدمه وارد نشود

5-علت استفاده زا روغن ایمرسیون برای عدسی 100میکروسکوپ چیست؟

آنزیم های اختصاصی موجود در بافت های گیاهی ترکیباتی با فعالیت بیولوژیکی متفاوت را کاتالیز می نمایند.

آنزیم کاتالاز جزء آنتی اکسیدان های آنزیمی است.( امروزه همه جا از فواید مواد آنتی اکسیدانی، از پیشگیری بیماری های قلبی گرفته تا کاهش آسیب مغز و چشم ها صحبت می شود. آنتی اکسیدان ها جلوی عمل رادیکال های آزاد را که موادی فعال و ویرانگر هستند، می گیرند و آنها را خنثی می کنند.

تولید رادیکال های آزاد، مسئله ای طبیعی است و در طی عمل تنفس به وجود می آید. رادیکال های آزاد تعدادی اتم تک الکترونی هستند و در حین واکنش اکسیژن با بعضی مولکول ها تولید می شوند. اگر بطور ناگهانی تعداد زیادی رادیکال آزاد در بدن تولید شود، باعث می شود یک سری واکنش هایی خاص پشت سر هم شروع شوند.)

و ویتامین ای ,اسیدآسکوربیک جز آنتی اکسیدان های غیر آنزیمی است.کاتالاز در سلول های جانوری و گیاهی موجود است که واکنش کاتالازی که انجام می دهد بصورت زیر است:

2H2O2→2H2O + O2

آب اکسیژنه یک اکسنده متداول است.ترکیب بسیار سمی که به هر علتی ممکن است درون سلول ایجاد شود که کاتالاز برای خنثی کردن این ترکیب سمی واکنش بالا را انجام دهد.( به مرور آب اکسیژنه تجزیه و تبدیل به آب و اکسیژن می‌گردد. این عمل تجزیه در محیط بازی سریعتر و در محیط اسیدی کندتر از محیط خنثی صورت می‌گیرد. اگر مدت مدیدی آب اکسیژنه را انبار کنند، ممکن است کاملا تجزیه و تبدیل به آب گردد. بر اثر گرد بعضی اجسام عمل تخریب آب اکسیژنه تسریع می‌گردد مانند گرد بی‌اکسید منگنز و گرد فلزات).

کاتالاز در پراکسی زوم وجود دارد و آب اکسیژنه ای که درون پراکسی زوم ایجاد می شود را خنثی کرده و تبدیل به مواد غیر سمی مثل آب و اکسیژن می کند.

*ساختمان پراکسی زوم:

پراکسی زوم دارای یک غشای به ضخامت حدود ۶۰ تا ۸۰آنگستروم است که با شبکه آندوپلاسمی صاف در ارتباط است. ماتریس یا ماده ی زمینه ای که درون پراکسی زوم را پر کرده است همگن بوده و دارای ذرات بسیار ریز تا حدی متراکم و گاهی رشته های منشعب به طول ۴ تا ۴.۵ نانومتر است.

آنزیم های موجود در پراکسی زوم:

کاتالاز (جهت تجزیه ی پراکسید هیدروژن یا آب اکسیژنه و تبدبل آن به آب و اکسیژن مولکولی - از بین بردن سمیت آب اکسیژنه)

آلفا -ال- هیدروکسیداز

د-آمینو اکسیداز ( اکسیداسیون اسید آمینه های نوع  د)

اوریکاز یا اورات اکسیداز ( تجزیه ی اسید اوریک حاصل از متابولیسم پورین ها)

گلی کواکسیداز ( هنگام تنفس نوری موجب اکسایش اسید گلی کولیک حاصل از فتوسنتز

آنزیم های لازم جهت بتا اکسیداسیون اسید ها یچرب

آنزیم ها ی لازم جهت تولید فسفولیپید پلاسموژن

آنزیم های لازم جهت سم زدایی ترکیبات بیگانه مانند اتانول

منشاء پراکسی زوم:

پراکسی زوم از جوانه زدن شبکه ی آندوپلاسمی صاف ایجاد می شود. غشای پراکسی زوم ها با دخالت شبکه ی آندوپلاسمی دانه دار یا خشن که هم پروتئین ها و هم لیپید ها را می سازد گسترش می یابد. پراکسی زوم ها جدید ممکن است از جوانه زدن شبکه ی پراکسی زوم ی به وجود آیند.*

کاتالاز ساختار هم دارد.مثل هموگلوبین که ساختار تتراپیرون حلقوی در مرکز خود آهن داشته باشد هم حاصل می شود.همیشه آنزیم ها در معرض سوبسترای خود نیستند.بعضی اوقات آنزیم و سوبسترا از هم جدا می شوند و مثال آنها سیب زمینی و سیب که در معرض هوا تغییر رنگ می دهد و در سلول های آن آنزیم درون یک اندامک و سوبسترا در اندامک دیگری استو واکنش انجام نمی شود ولی با برش زدن اندامک ها پاره شده و آنزیم و سوبسترا واکنش داده و تغییر رنگ صورت می گیرد.

استخراج آنزیم ها از گیاه هدف ماست چون آنزیم کاتالاز بالایی دارد.

وسایل مورد نیاز:

بوته چینی-دستمال تنظیف-کاغذ صافی-بشر-تایمرسنج

مواد مورد نیاز:

چمن-آب مقطر-آب اکسیژنه

مراحل آزمایش:

2گرم چمن را داخل بوته چینی ریختیم و 20 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه کردیم و عصاره آنرا در آوردیم سپس محلول را با تنظیف صاف کردیم سپس حجم نهایی محلول را به 40میلی لیتر رساندیم.محلول صاف شده را به عنوان یک واحد آنزیمی در نظر گرفتیم(یعنی غلیظ ترین حالت)و می خواهیم غلظت های متفاوتی از محلول را به وجود آوردیم(2/0 , 4/0, 6/0, 8/0)

N1 V1 = N2 V2میزان واحد آنزیمی: 

1 x X= 0/2x 10→ X=2

1 x X=0/4x 10→ X=4

1 x X=0/6 x 10→ X=6

1 x X=0/8 x 10→ X=8

سپس با آب مقطر به حجم 10  رساندیم:

8میلی لیتر آب مقطر + 2 میلی لیتر واحد آنزیمی= 2/0(غلظت)

6میلی لیتر آب مقطر + 4 میلی لیتر واحد آنزیمی= 4/0

4میلی لیتر آب مقطر + 6 میلی لیتر واحد آنزیمی= 6/0

2میلی لیتر آب مقطر + 8 میلی لیتر واحد آنزیمی= 8/0

واحد آنزیمی=1

سپس در 5 بشر یک اندازه 20میلی لیتر آب اکسیژنه ریختیم. سپس در محلول های ساخته شده  هر کدام یک دایره کاغذ صافی انداختیم(قطر دایره کاغذ صافی از قطر بشر کوچکتر بود تا راحت وارد بشر شود)تا کاغذ به ماده آغشته شود و بعد به بشر حاوی آب اکسیژنه انداختیم.در این مرحله زمان, وارد شده به ظرف تا بازگشت کاغذ به سطح بشر را با تایمرسنج محاسبه کردیم.

محاسبات و نتایج:

غلظت= 2/0         4/0                6/0                8/0                 1

زمان= 40           89/37             13/36            20                  19

سوال:

علت تفاوت در زمان؟دلیل میزان غلظت واحد آنزیمی می باشد.با کاهش غلظت میزان زمانی که طول می کشد برگه به سطح باز گردد افزایش می یابد.هر چه غلظت واحد آنزیمی زیاد تر باشد میزان اکسیژن تولید شده بیشتر است و زمان کمتری طول می کشد تا کاغذ به سطح باز گردد و برعکس.غلظت با زمان رابطه عکس دارد.

چرا کاغذ بالا می آید؟طبق فرمول زیر

2H2O2→2H2O + O2

پس از انتقال آنزیم کاتالاز به آب اکسیژنه ,اکسیژن آزاد می شود که این اکسیژن تولید شده موجب می شود کاغذ صافی به سطح آب باز گردد.

1-طول سلول های رنگ شده و طول سلول های زنده را در بزرگنمایی های 4 و 100 به دست آورید(با محاسبه)

سلول زنده:

**بزرگنمایی 4= سلول بشره پیاز + آب مقطر

طول سلول ها در بزرگنمایی 4 = 12,10,14,12,13,15,11,9,11,10

میانگین= 7/11

 طول سلول :

 مقیاس درجات میکرومتر چشمی برای عدسی4Xمیانگین

  11/7x 22=257/4 میکرون**

 **بزرگنمایی10= سلول بشره پیاز + آب مقطر

طول سلول ها در بزرگنمایی10=25,24,17,16,22,37,25,22,22,24

میانگین=4/23

 طول سلول:

 مقیاس درجات میکرومتر چشمی برای عدسی10Xمیانگین

23/4 x 10 = 234 میکرون**

سلول رنگ شده:

**بزرگنمایی 4= سلول بشره پیاز +لوگل

طول سلول ها در بزرگنمایی 4 = 12,13,9,10,10,7,6,9,8

میانگین= 4/9

 طول سلول:

 مقیاس درجات میکرومتر چشمی برای عدسی4Xمیانگین

9/4 x 22 = 206/8 میکرون**

**بزرگنمایی10= سلول بشره پیاز + لوگل

طول سلول ها در بزرگنمایی10=18,20,23,19,22,21,21,20,21,17

میانگین=2/20

 طول سلول:

 مقیاس درجات میکرومتر چشمی برای عدسی10Xمیانگین

20/2 x 10 =202 میکرون**

 2-طول سلول های رنگ آمیزی شده را با طول سلول های زنده در بزرگنمایی های 4 و 10 مقایسه کنید.آیا اعداد به دست آمده در بزرگنمایی های مختلف تفاوت دارد یا خیر؟چرا؟

بلی تفاوت دارد. طول سلول های رنگ آمیزی شده نسبت به طول سلول های زنده در بزرگنمایی های 4 و 10کوچکتر شده است.زیرا با رنگ آمیزی کردن سلول می میرد.سلول مرده نسبت به سلول زنده همواره کوچکتر می شود,در سلول های مرده پتانسیل آب کاهش می یابد و نوعی عمل پلاسمولیز صورت می گیرد.

3-آیا میانگین طول سلول های رنگ شده نسبت به طول سلول های زنده تغییری پیدا کرده؟چرا؟

بلی تفاوت دارد.  زیرا طول سلول های رنگ آمیزی شده نسبت به طول سلول های زنده در بزرگنمایی های 4 و 10کوچکتر شده است. .با کوچکتر شدن اعداد در سلول های مرده میانگین آن  نیز کاهش می یابد.

آزمایش3

1-قطر هسته ی سلول های رنگ شده و قطر هسته ی سلول های زنده را در بزرگنمایی 40 به دست آورید.با محاسبه

**بزرگنمایی40=اندازه هسته زنده

طول هسته=9,10,8,11,10,7,9,10,11,10

میانگین= 5/9

 طول سلول:

 مقیاس درجات میکرومتر چشمی برای عدسی40Xمیانگین

9/5 x 40= 380 میکرون**

**بزرگنمایی40=اندازه هسته مرده

طول هسته=10,10,10,10,10,10,10,10,10,10

میانگین=10

 طول سلول:

 مقیاس درجات میکرومتر چشمی برای عدسی40Xمیانگین

10 x 40=400 میکرون**

2-قطر هسته های رنگ شده را با قطر هسته های زنده در بزرگنمایی 40 مقایسه کنید.آیا قطر هسته ی سلول های رنگ شده با قطر سلول های زنده تفاوت دارد؟

تفاوت چشمگیری ندارد.تمام هسته ها حدودا 10 میکرون است.

آزمایش 1 (حروف روزنامه)

1- نتیجه مشاهدات خود را بنویسید و با ذکر دلیل توضیح دهید.

حرف را با بزرگنمایی 4 به صورت زیر مشاهده کردیم.

P -------------------d

که تصویر چپ و راست و معکوس شده است.

در این سوال چون نوع تشکیل تصویر مورد نظر است پس قوانین تشکیل تصویر مورد بحث است.

تشکیل تصویر در میکروسکوپ از قوانین کلی تشکیل در عدسی های محدب پیروی می کند.ابژکتیو از جسم تصویر اول را می سازد که تصویری حقیقی بزرگتر و معکوس است.بعد اکولر تصویر حاصل از ابژکتیو را به صورت معکوس مجازی و بزرگتر در می آورد.(تصویر نهایی)فاصله کانونی اکولر از فاصله کانونی ابژکتیو بیشتر است در نتیجه بزرگنمایی اکولر از بزرگنمایی ابژکتیو کمتر بوده چون فاصله کانونی با بزرگنمایی رابطه عکس دارد.اگر فاصله اکولر کم شود ,تصویر مجازی تشکیل نمی شود و اصولا شرایط فیزیکی تشکیل تصویر به هم  می خورد.

آزمایش2(عکس روزنامه)

1-در بزرگنمایی های مختلف چه تفاوت هایی را مشاهده می کنید؟توضیح دهید.به عنوان مثال در یک  محدوده مشخص چه تغییراتی در بافت روزنامه,تعداد نقاط مشاهده شده در بزرگنمایی های مختلف دیده می شود؟

بزرگنمایی4=میدان دید زیاد-تعداد نقاط تصویر زیاد-جزئیات تصویر کم-وضوح تصویر کم

بزرگنمایی10=میدان دید کم-تعداد نقاط تصویر کم-جزئیات تصویر زیاد-وضوح تصویر بیشتر

بزرگنمایی40=میدان دید کمتر-تعداد نقاط تصویر کمتر-جزئیات تصویر خیلی بیشتر-وضوح تصویرخیلی بیشتر(بافت روزنامه و عکس مشخص تر است و رنگ ها تفکیک می شود)

دید کلی:از بزرگنمایی کم به زیاد: میدان دید کم-تعداد  نقاط تصویر کم-جزئیات تصویر زیاد

آزمایش3(تار مو)

1-نتیجه مشاهدات خود را بنویسید.

بزرگنمایی4=دو تار مو را با هم مشاهده کردیم و در نقطه تقاطع موی بالا و پایین هر دو مو واضح است.

بزرگنماایی10= دو تار مو را با هم مشاهده کردیم و در نقطه تقاطع موی بالا و پایین هر دو مو واضح است.

بزرگنمایی40=موی بالایی واضح است.بعد از تنظیمات هر دو مو واضح می شوند.

2-آیا هنگام تنظیم میکروسکوپ ابتدا موی بالایی واضح دیده می شود یا موی پایینی ؟چرا؟

در بزرگنمایی 4 و 10 تار مو را با هم مشاهده کردیم و در نقطه تقاطع موی بالا و پایین هر دو مو واضح است.(توان تفکیک زیاد)اما در بزرگنمایی40 چون قدرت تفکیک کم می شود موی بالایی واضح تر است.  میدان دید کم-تعداد نقاط تصویر کم-جزئیات تصویر زیاد بنابراین مویی که به عدسی نزدیکتر است واضح تراست.

3-وقتی که موها را با عدسی قوی مشاهده می کنید,هنگامی که موی بالایی را کاملا واضح میبینید آیا موی پایینی هم همان قدر واضح دیده می شود یا خیر؟چرا؟

خیر- در بزرگنمایی 40 در ابتدا وقتی بلافاصله بزرگنمایی را روی 40 گذاشتیم فقط تار موی بالایی مشاهده شد.چون بزرگنمایی زیاد شده و قدرت تفکیک کم می شود و میدان دید کمتر-تعداد نقاط تصویر کمترشده با کم شدن نقاط تصویر ما نیز نقاط کمتری را مشاهده کرده و در نتیجه تار موی نزدیک تر زودتر دیده می شود و فقط تار موی بالایی مشاهده می شود.بعد از تنظیم کردن توسط پیچ میکرو فاصله ی بین عدسی و لام را افزایش می دهیم تا قدرت تفکیک زیاد شود بنابراین بعد از تنظیمات می توانیم موی بالا و پایین را با هم ببینیم.اما باز هم وضوح موی پایینی به خوبی نیست.

4-آیا با عدسی قوی میتوان به طور همزمان هر دو مو را کاملا واضح دید؟

بله. بعد از تنظیم کردن توسط پیچ میکرو فاصله ی بین عدسی و لام را افزایش می دهیم تا قدرت تفکیک زیاد شود بنابراین بعد از تنظیمات می توانیم موی بالا و پایین را با هم ببینیم.

آزمایش4(خط کش میلی متری)

1-اعداد به دست آمده از اندازه گیری قطر میدان دید میکروسکوپ را در بزرگنمایی های 4 و 10 یادداشت کنید.

بزرگنمایی4= 5/4 میلی متر

بزرگنمایی10=5/1 میلی متر

2-آیا به نظر شما قطر میدان دید میکروسکوپ در بزرگنمایی 4 و 10تغییر کرده؟درصورت مثبت و یا منفی بودن جواب,دلایل خود را بیان کنید.

بله.با افزایش بزرگنمایی, قطر میدان دید کم-تعداد  نقاط تصویر کم-جزئیات تصویر زیاد.

آزمایش5(دستمال کاغذی)

1-نتیجه مشاهدات خود را در هنگام استفاده از عدسی های ضعیف و قوی بنویسید.

بزرگنمایی4=توده های در هم تنیده از رشته های دستمال-نازک ظریف-تعداد رشته ها زیاد

بزرگنمایی10=تراکم رشته ها کمتر پس تعداد رشته ها کم تر-بافت ها بزرگتر

بزرگنمایی40=بافت ها واضح بزرگ و قابل تشخیص-در ساختمان آنها یک سری بافت های مجزا به صورت سلول مشاهده شد.

2آیا با مشاهده میکروسکوپی می توان به ساختار دستمال کاغذی پی ببرید؟توضیح دهید

بله. بزرگنمایی40=بافت ها واضح بزرگ و قابل تشخیص-در ساختمان آنها یک سری بافت های مجزا به صورت سلول مشاهده شد.پس ساختار آن(رشته های دستمال)قابل تشخیص است.

به سوالات زیر پاسخ دهید:

1-میکروسکوپی که با آن کار کرده اید واجد چند ابژکتیو می باشد؟توضیح دهید

ابژکتیو خشک و ایمرسیون که در گروه:روش به کار گیری قرار دارند.

ابژکتیو خشک:وقتی محیط شفاف بین جسم و ابژکتیو هوا و گاز باشد.

ابژکتیو ایمرسیون:اگر این فاصله را مایعی(آب,گلیسرین,روغن سدر,آلفا برومو نفتول و ...) پر کند.

2-اعداد حک شده بر روی هر ابژکتیو بیانگر چیست؟توضیح دهید.

بر روی هر ابژکتیو اعداد مختلفی حک شده که نشانگر بزرگنمایی,زاویه گشودگی,طول لوله میکروسکوپ مناسب,شماره سریال و ضخامت لامل مناسب برای مشاهده با آن ابژکتیو می باشد.فاصله ی کانونی برخی از ابژکتیو ها نیز بر روی لوله ابژکتیو ثبت شده.برخی ویژگی های دیگر ابژکتیو هم بر روی آنها مشخص می شود.برای مثال:

برای ابژکتیو ایمرسیون oil

برای ابژکتیو فاز ph

برای میکروسکوپ پلاریزن و .... pol

3-از مقایسه این اعداد در ابژکتیو های مختلف چه نتیجه هایی می گیرید؟

ساختار و بنای هر ابژکتیو مربوط به خودش است.و کارایی آن را با ابژکتیو های دیگر تمایز می بخشد.

4-مخروط روشنایی چیست؟

مجموعه پرتوهای شکسته یافته و نیز پرتوهای که مستقیما از جسم می گذرد و وارد ابژکتیو می شود مخروط روشنایی را به وجود می آورند.

5-رابطه بین بزرگنمایی عدسی ابژکتیو با توان یا قدرت تفکیک چگونه است؟

بزرگنمایی:ابژکتیو در اندازه های بزرگنمایی مختلف یافت می شوند که معروفترین آنها 4,10,40,و100 می باشد.هر چه بزرگنمایی بیشتر شود عدسی ها ریزتر و فاصله کانونی آنها کمتر می شود.لذا بزرگنمایی آنها به صورت  زیر می باشد:

   4x 10x 40x 100x

توان تفکیک:کوچکترین فاصله قابل تشخیص بین دو نقطه واقع بر یک سطح را به وسیله یک سیستم نوری قابل رویت باشد توان تفکیک آن دستگاه گویند.هر چه مقدار عددی توان تفکیک کمتر باشد قدرت تفکیک دستگاه نوری بیشتر است.

پس رابطه بین این دو عکس می باشد.

6-کار ابژکتیو چیست؟

عمل کلی آن تشکیل اولین تصویر از جسم است.این تصویر بزرگتر از جسم,معکوس و حقیقی است.

7-نقش  کندانسور در یک میکروسکوپ در چیست؟

کندانسور از مجمو عه ای از عدسی های محدب یا محدب الطرفین تشکیل شده است که عمل آنها همگرا کردن پرتو های نوری حاصل از منبع روشنایی و تابیدن آنها بر روی جسم است تا نور کافی برای مشاهده جسم فراهم شود.

8-نقش دیافراگم چیست؟

دیافراگم وسیله ی تنظیم شدت نور میکروسکوپ است.هر میکروسکوپ به طور معمول دارای دیافراگم زمینه ,دیافراگم کندانسور و دیافراگم اکولر است.دیافراگم زمینه:شدت نوری که از منبع روشنایی به کندانسور می رسد را تنظیم می کند و معمولا در بالای منبع نور قرار دارد.دیافراگم کندانسور:شدت نوری که از کندانسور گذشته و به جسم می رسد را تنظیم می کند و اغلب در زیر کندانسور قرار دارد.دیافراگم اکولر:بر حسب نوع اکولر در داخل لوله ی اکولری(اکولر-)و یا خارج از لوله ی اکولری(اکولر+).

9-علت استفاده از روغن ایمرسیون در بزرگنمایی های بالا(100)چیست؟

در بزرگنمایی های بالا که به نور بیشتری نیاز است از شرایط ایمرسیون استفاده می شود که ضمن آن مایع موجود در فاصله فرونتال کار یک عدسی محدب را  انجام می دهد.چون ضریب شکست محیط ایمرسیون از لام شیشه ای بیشتر است ,پرتو های نوری را همگرا کرده,به ابژکتیو می رساند.به این ترتیب از هدر رفتن پرتو جلوگیری می شود و تصویر واضح تری به دست می آید.

10-از فیلتر ها چه استفاده ای در میکروسکوپ می شود؟

در میکروسکوپ,فیلترها,صفحات شیشه ای رنگین تیره رنگ با دانه دانه ساییده شده ای هستند که از آنها جهت ایجاد روشنایی یکنواخت ,پراکندگی نور و بالا بردن کنتراست(تضاد)استفاده می شود.از آنجا که هر فیلتری طیف همرنگ خود را عبور می دهد و از عبور طیف ها ی مکمل رنگ خود جلوگیری می کند با استفاده از فیلتر های رنگی می توان تک رنگ دلخواه و مناسب برای هر مشاهده را فراهم ساخت و یا برای افزایش کنتراست به هنگام عکس برداری میکروسکوپی از فیلتر مناسبی استفاده کرد.

11-چگونه می توان قدرت تفکیک میکروسکوپ را اصلاح کرد و افزایش داد؟

حد تفکیک میکروسکوپ از فرمول زیر بدست می آید:

R=0/61λ/n.sinα

هر چه مقدار عددی حد تفکیک کاهش یابد توان میکروسکوپ بهبود یافته یا به عبارتی افزایش می یابد .دو امکان برای کم کردن حد تفکیک وجود دارد:

1-کاهش طول موج نور استفاده شده در میکروسکوپ (استفاده از نور های با طول موج کوتاهتر)

2-افزایش عدد گشادگی(مخرج کسر)

 میزان تغییرات زاویه گشودگی ناچیز است(عدد گشادگي يك عدسي شيئي ميكروسكوپ مقياسي است از توانائي آن عدسي درجمع كردن نوروتجزيه دقيق اجزاء نمونه در يك نمونه با فاصله ثابت مي باشد. امواج نوري تشكيل دهنده تصوير عبور كرده از شيئي وارد عدسي شيئي مي شوند. اين امواج تشكيل يك مخروط نوري  معكوسي را مي دهند.افزايش عدد گشادگي و در  نتيجه بهبود بخشيدن به كار ميكروسكوپ ميتوان ضريب شكست محيط شفاف بين نمونه و عدسي شيئي را افزايش داد .ضريب شكست هوا ۱ و ضريب شكست آب مقطر ۱.۳۳ و ضريب شكست روغن سدر ۱.۵ و ضريب شكست آلفا برمو نفتل ۱.۶ مي باشد   بنا براين تغييرات ضريب شكست بين ۱ تا ۱.۶ مي باشد.آلفا نيم زاويه راس مخروط روشنائي است پرتو هاي زيادي از جسم خارج مي شوند اما تنها بخش كوچكي از آنها وارد عدسي شيئي مي گردند كه همين پر توها مخروط روشنائي را مي سازندزاويه راس مخروط روشنائي ۲آلفا و آلفانيم زاويه راس مخروط روشنائي مي باشد.و آلفا يا سينوس آن با شعاع عدسي شيئي و در نتيجه قطر عدسي شيئي رابطه مستقيم دارد و هر چه قطر عدسي شيئي بيشتر گردد آلفا نيز بيشتر مي شود.هر چه بزرگنمائي عدسي شيئي بيشتر شود فاصله كانوني آن كم تر مي شود و در نتيجه راس مخروط روشنائي به قاعده آن(همان قطر عدسي شيئي)نزديك تر مي شود.و زاويه ۲آلفا به ۱۸۰ درجه نزديكتر مي شود اگر بر فرض جسم با عدسي شيئي تماس پيدا كند(فرض محال) زاويه ۲آلفا ۱۸۰ درجه مي شود و آلفا ۹۰ درجه مي شود و سينوس آن برابر با يك مي شود و چون جسم نمي تواند با نمونه تماس داشته باشد در نتيجه مقدار سينوس آلفا هميشه از يك كمتر است.گر سينوس آلفا را 1 فرض كنيم و ضريب شكست را نيز حد اكثر 1.6 در نظر بگيريم بنا براين بنابراين 1در 1.6 مي شود)

 پس عملا راه اصلی کاهش فرمول فوق و دستیابی به توان تفکیک بهتر ,به کار گیری طول موج های کوتاه تر ,مثلا پرتو های بنفش و یا فرا بنفش است.

12-آیا بخشی از تصویر جسم که در میدان دید ابژکتیو قرار دارد در بزرگنمایی های مختلف تغییر می کند؟توضیح دهید.

بله.با افزایش بزرگنمایی میدان دید کم می شود.یعنی محدوده ی کمتری از جسم را در بزرگنمایی بالا می توان مشاهده نمود در عوض جزئیات زیاد می شود.

دیگر سوالات:

1-مشخصات حک شده بر روی عدسی 100 میکروسکوپ خود را بنویسید و مشخص کنید هر کدام نمایانگر چیست؟

بزرگنمایی=100

25/ 1oil

160=طول لوله

017/0= ضخامت لام

2-بزرگنمایی عدسی چشمی  میکروسکوپی خود را بنویسید.

10

                   :تئوری آزمایش

روش ساده اي است براي جدا كردن مواد حل شده در يك حلال ، از اين روش براي شناسايي مواد نيز مي توان استفاده نمود و انواع مختلف دارد كروماتوگرافي كاغذي ، ستوني ، گازي و مايع. در اين روش فاز متحرك مانند آب از فاز ساكن(ثابت) مانند كاغذي يا گچ عبور مي كند و به سمت بالا مي رود. هنگامي كه به لكه رنگين مانند جوهر مي رسد، هر جزء از جوهر را كه جاذبه كمتري با كاغذ (فاز ساكن) دارد كه از جزئي كه جاذبه قوي تري دارد جدا مي كند و با سرعت بيشتري به جاي بالاتر مي برد و بدين ترتيب اجزاي مخلوط از هم جدا مي شوند.

مثال : جدا سازي مواد موجود در يك قطره خون.

همه انواع کروماتو گرافی دارای اجزای زیر هستند:

که مایع و یا گاز می باشد.                   :(Mobile phase) فاز متحرک

:که می تواند مایع ویاجامد باشد.           (Stationary phase) فاز ثابت

به طور کلی فاز متحرک به دلیل جریانی که دارد از کنار یا درون فاز ثابت عبور می کند و بر اساس تمایل اجزای مختلف نمونه مورد نظر باسرعتهای مختلف توسط فاز متحرک شسسته می شوند. اگر ماده مورد آنالیز تمایل کمتری به فاز ثابت داشته باشد در نتیجه سریعتر توسط فاز متحرک شسته می شود و اگر بیشتر به فاز ثابت تمایل داشته باشند باسرعت کمتر شسته می شوند و به این ترتیب مواد از هم تفکیک می شوند.به عبارت دیگر اجزاء مختلف نمونه بر اساس اینکه با چه شدتی توسط فاز ثابت نگهداشته می شوند از هم جدا می گردند.

از انواع كروماتوگرافي مي‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

1.كروماتوگرافي روي كاغذ

 Paper Chromatography (PC)

2.كروماتوگرافي روي لايه نازك

( Thin Layer Chromatography (TLC

3.كروماتوگرافي مایع با کارایی بالا(HPLC)

  High Performance Liquid Chromatography  

4.كروماتوگرافي گازي  Gas Chromatography (GC)

5.کروماتوگرافی ستونی(CC):درکروماتوگرافی ستونی از یک ستون شیشه ای استفاده مشود که درونآنفاز ثابت را قرار میدهند و سپس مواد مورد آزمایش را که در حلال حل نموده اند ازبالا درون ستون میریزند که در این هنگام بر اساس جذب سطحی یا بر اساس اندازه ی مولوکولها از بالا به پایین مواد از همدیگر جدا میشوند.

كروماتوگرافي روي كاغذ:  :Paper Chromatography (PC)

در این نوع کروماتو گرافی پس از استخراج ماده مورد آنالیز آن رادر حلال مناسب حل کرده و روی کاغذ لکه گذاری می کنیم. سپس آن را داخل تانک قرار می دهیم که در آن فاز متحرک قرار دارد. به دلیل کشش سطحی حلال روی سطح کاغذ بالا آمده و اجزاء مختلف بر اساس حلالیت و تمایل شان به فاز ثابت در محلهای مختلف باقی می مانند. هرچه اجزاء مخلوط بیشتر در حلال

حل شوند روی سطح کاغذ بیشتر بالا می روند. و به این ترتیب از هم جدا می گردند. در مرحله بعد باید سپس بایستی با معرف مناسب لکه هارا ظاهر و قابل دید نمود.

كروماتوگرافي بر روي لایه نازك(TLC)

 این روش ساده ترین و مفید ترین روش تشخیص اولیه و خلوص مواد است. در این روش فاز ثابت روی یک صفحه از جنس پلیمر یا آلومینیوم کشیده می شود .که جنس فاز ثابت ترکیباتی نظیر سیلیکاژل ویا آلومینا می باشد. در این نوع کروماتو گرافی پلاریته اهمیت زیادی دارد.روش کار مانند کروماتو گرافی کاغذ می باشدو بطور خلاصه شامل مراحل ذیل است:

استخراج دارو ویا ماده مورد آنالیز از ادرار بوسيله حلال آلی، تغليظ حاصل استخراج و حل کردن آن در یک حلال آلی ، لکه‌گذاري روي صفحه TLC، جداسازي تركيبات بوسيله فاز متحرك، ظهور و شناسایی داروهاي تفكيك شده توسط معرف‌هاي شيميايي شناخته شد، استفاده از  RF(نسبت حرکت نمونه مورد آنالیز روی صفحه TLC به حرکت جبهه فاز متحرک)، استفاده از جذب UV يا فلورسانس. توجه به نكاتي مثل خصوصيات فاز متحرك، فاز ثابت، اشباع بودن يا نبودن تانك در جداسازي و شناسايي دارو مؤثر است.

 TLC مزايا

ساده ترین و مفید ترین روش تشخیص اولیه و خلوص مواد است. موادي   كه به هنگام لكه‌گذاري بر روي صفحه قرار داده مي‌شوند، پس از تفکیک شدن بر روي آن باقي مانده و در نهايت در صورت بكارگيری آشکار سازهای مناسب، قابل شناسایی و مشاهده خواهند بود.

كاربرد ساده داشته و نياز به تجهیزات اندك دارد.

قابليت جداسازي و شناسايي مقادير ناچیزمواد را دارا می باشد.

زمان انجام آزمایش كوتاه است.

می توان چندین نمونه را هم زمان آزمایش کرد.

از فازهای ثابت و متحرک متنوع می توان استفاده نمود.

از معرفهای ظاهر کننده متنوع می توان استفاده نمود.

TLC معایب

حساسیت آن کمتر از روشهای GC,GC/MS,HPLC   می باشد.

دقت وصحت آن کمتر از روشهای فوق می باشد.

گاز کروماتو گرافی (GC)

در روش گازکروماتو گرافی فاز متحرک گاز است. ماده مورد آنالیز تحت فشار گاز در طول ستون کروماتو گرافی که توسط ذرات فاز ثابت پر شده است، حرکت کرده وبر اساس پلاریته با سرعتهای متفاوتی در طول ستون حرکت می کنند ودر نتیجه با فواصل زمانی مختلفی از انتهای ستون خارج شده و توسط آشکار ساز   (Detector)شناسایی می شود.

 اين روش از حساسيت و دقت بالایی برخوردار است. روش كلي كار عبارتست از استخراج دارو با يك حلال مناسب، تغليظ حاصل استخراج و تبديل آن به يك مشتق فرار (مشتق‌سازي)، تزريق به دستگاه گاز كروماتوگراف، عبور فاز متحرك گازي به همراه نمونه مورد آنالیز از ستون و بالاخره، شناسايي و ثبت توسط آشكارساز.

 معمولاً به منظور افزایش حساسيت، دقت و صحت دستگاه گاز كروماتوگراف،آن را به طيف سنج جرمي متصل می کنند که به آن (GC/MS) می گویند.این روش ، روش مرجع برای تشخیص بسیاری از دارو ها، مواد مخدرو مواد مورد آنالیز می باشد.

با توجه به اینکه این روشها گران بوده و استفاده از آنها نیاز به تخصص دارد.بعلاوه نیازمند خدمات مناسب بعد از فروش می باشد،لذا مواردی از این قبیل استفاده از این سیستمها رادچار محدودیت میکند. از اینرو از روشهای ساده تر و کاربردی دیگری که در عین حال از حساسیت و دقت مناسب برخوردار باشند (نظیر TLC) استفاده می شود.

2-4-كروماتوگرافي مايع با كارایی بالا (HPLC)

در روش کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا فاز متحرک مایع است. ماده مورد آنالیز تحت فشار پمپ در طول ستون کروماتو گرافی که توسط ذرات فاز ثابت پر شده است حرکت کرده وبر اساس پلاریته با سرعتهای متفاوتی در طول ستون حرکت می کنند در نتیجه با فواصل زمانی مختلفی از انتهای ستون خارج شده و توسط آشکار ساز   (Detector)شناسایی می شود. اين روش از حساسيت و دقت بالایی برخوردارمی باشد. روش كلي كار در HPLC شامل مراحل زير است:

استخراج با يك حلال مناسب، تزريق حاصل استخراج به دستگاه و حرکت آن به همراه فاز متحرك مناسب با فشار بالا به داخل ستون ، تفکیک آن و بالاخره تشخیص بوسیله آشکار ساز واندازه گيري تركيبات مورد نظر براساس سطح زير منحني پيك‌هاي بدست آمده می باشد. امروز توسعه و تجهيز HPLC منجر به ساخت دستگاههاي كاملاً خودكار و منعطف براي سيستم‌هاي مختلف شده است. اين روش از حساسيت و دقت  بالايي برخوردار است.

برای نمونه روش کروماتوگرافی کاغذی را مورد آزمایش قرارمیدهیم.    

وسایل و مواد مورد نیاز:

کاغذ کروماتوگرافی/حلال/کبالت/مس/آهن/تانک

روش کار:

یک کاغذ کروماتوگرافی برداشته یک خط افقی با مداد روی آن کشیدیم.و از محلول ها به میزان یک قطره روی آن ریخته و بعد کاغذ را داخل تانک که حاوی 2میلی لیتر آب مقطر,4سی سی

 و 16سی سی استات است گذاشتیم تا بالا بیاید و فاز محرک با رنگ خودش را نشان دهد.HCl

                                                                                                       تئوری آزمایش:

فرآیند استخراج
در فرآیند استخراج ، ترکیبی را که در یک حلال حل شده است در مجاورت حلال دیگری که غیر قابل اختلاط با حلال اول باشد قرار می دهند . ترکیب مورد نظر در حلالی که خصوصیاتش شبیه به خودش می باشد بیشتر حل می شود . مثلا اگر متانول به مخلوط آب و پنتان اضافه شود تقریبا تمام آن در لایه آبی حل می شود . چون گروه هیدروکسیل الکل با آب پیوند هیدروژنی برقرار می کند نسبت غلظت یک ماده در حلال دوم به غلظت ان در حلال اول را ضریب توزیع هنگامی که حجم دو حلال با یکدیگر برابر باشند بجای غلظت می توان مقدار گرم جسم را در حلال دوم قرارداد. برای استخراج یک ماده ، چند استخراج با حجم های کمتر بهتر از یک استخراج با تمام حجم حلال می باشد.

حلال استخراج کننده باید خصوصیات زیر را داشته باشد

غیر قابل اختلاط باشد ، در غیر این صورت غیر قابل استفاده است .
نسبت به ماده حل شده بیشترین ضریب تولید را داشته باشد .
با ماده مورد نظر واکنش شیمیایی انجام ندهد .
نقطه جوش حلال استخراج کننده پایین باشد .
در استخراج ساده از قیف جداکننده استفاده می شود . قیف های جداکننده به شکلهای گوناگونی وجود دارند . هر چه قیف درازتر باشد زمانی که لازم است تا دو فاز مایع از تکان دادن از هم جدا شدند بیشتر می شود . برای انجام استخراج ، محلول را در قیف جداکننده می ریزند و به آن مقداری از حلال استخراج کننده می افزایند . قیف و محتویات آنرا باید به شدت تکان داد تا دو مایع تا حدی که ممکن است با هم تماس پیدا کنند و به تعادل برسند . پس از کامل شدن استخراج ، قیف را روی یک حلقه قرار داده و بلافاصله در پوش آنرا برداشته و اجازه می دهیم تا لایه ها از هم جدا شوند.
لایه های آلی معمولا در بالا قرار می گیرند و لایه های آبی در پایین . البته حلالهای آبی که دو یا چند هالوژن در واحد فرمول خود دارند در پایین آب قرار می گیرند
گاهی اوقات دو لایه براحتی از هم جدا نمی شوند که می توان با افزودن محلول اشباع کلرید سدیم به جدا شدن آنها کمک نمود . برای سهولت استخراج می توان از استخراج پیوسته استفاده نمود . در این روش محلولی از حلال استخراجی و جسم بوسیله دستگاه مخصوصی دائما از مخلوطی که باید استخراج شود جدا شده و بداخل یک ظرف جوشش میریزد . این محلول بطور دائم تقطیر می شود و حلال آن به ظرف استخراج باز گشته و مصرف می گردد و جسم استخراج شده در ظرف جوشش جمع شده و غلظت آن مرتبا افزایش می یابد . حلال وقتی در مبرد متراکم می شود با توجه به دانسیته نسبی به طرف بالا یا پایین محلولی که محتوی ترکیب مورد نظر است جریان می یابد

استخراج ترکیبات آلی
 جدا سازی محصول اصلی یا محصول یا محصولات فرعی در یک واکنش شیمیایی :1
در قدیم بهترین روش سنتز (که متنوع نبود ) در فاز مایع بود اما جدیدا در فاز جامد است و نیازمند استخراج است
در فاز جامد از یک بستر پلیمری استفاده می کنیم ، ماده ای را که می خواهیم به بستر پلیمر متصل شود، به عنوان مثال A را به پلیمر متصل می کنیم بعد B را با آن واکنش می دهیم ، C و D ( محصولات ) چسبیده به پلیمر تشکیل می شوند ، وقتی پلیمر را می شوییم اگر A و B اضافی در محیط باشد خارج می شود ، می توانیم برای شست و شو از حلال های مختلفی استفاده کنیم چون با پلیمر واکنش نمی دهد

(سنتز در فار جامد : برای مواد آلی پیچیده )
و اما ادامه ی مطلب : آ و ب را که به عنوان واکنش دهنده وارد ترکیب کرده ایم بخشی مواد آلی و بخشی ترکیبات معدنی هستند ، ( فرض : ترکیبات معدنی در آب حل می شوند ) این مجموعه را چند بار شست و شو می دهیم تا فاز آلی و آبی جدا شود به شرطی که از ماده ی اصلی با آب ترکیب نشود که اگر ترکیب شود باید حلالیت را کاهش دهیم ( باید حلالیت ماده ی آلی را در فاز آبی تغییر دهیم یعنی Ksp را کاهش دهیم ، برای آن از نمک ها استفاده می کنند یعنی به جای آب محلول نمک طعام با غلظت بالا تهیه کرده و حل می کنند ، حلالیت ترکیب آلی کاهش یافته رسوب می کند و می توان با صافی جدا کرد ) شرط این که عمل استخراج را با راندمان بالا انجام دهیم این است که حلالیت دومی که بعدا از آب انتخاب می کنیم (با آب اختلاط نشود). 


استخراج

 خارج کردن یک ماده از یک حلال آلی یا آبی و بردن آن به یک حلال آلی یا آبی دیگر و اجازه دهیم که فاز آلی و آبی از هم جدا شوند سپس خدمان آن ها را جدا کنیم و با تبخیر و تقطیر ماده ی مورد نظر را از حلال جدا کنیم

 خالص سازی یک ترکیب آلی و جدا سازی آن از ناخالصی هایش :2

حلالی را انتخاب می کنیم که آ در آن  خوب حل شود و ب کمتر.و در واقع ب یک ناخالصی برای آ باشد. و در حلال دیگر ناخالصی بیشتر حل شودو آ کمتر.(( به شرطی که این حلال ها باهم اختلاط ندهند )) .اکثر این روش ها به وسیله ی حلال های غیر فعال شیمیایی صورت می گیرد

حلال غیر فعال شیمیایی

 معمولا هیچ واکنشی با مواد انجام نمی دهند و فقط کمک می کنند به حل شدن فیزیکی ماده ی آلی

 جدا سازی ترکیبات آلی بوسیله ی حلال های فعال شیمیایی 3:

این دو ترکیب در آب حل نمی شوند و در حلال آلی مثل اتر حل می شوند .حال تکلیف چیست ؟ از حلال های غیر فعال شیمیایی نمی توانیم برای جداسازی دو ترکیب فوق استفاده کنیم ، بنابر این از حلال های فعال شیمیایی استفاده می کنیم ، باید کاری کنیم که یکی از این ترکیبات در آب حل نشود .

حلال های فعال شیمیایی

 اسیدها و باز ها و محلول های نمکی یا نمک ها

بنزیلات سدیم در آب حل می شود ، پس کافی است روی ترکیبات آب بریزیم که مرزی ایجاد خواهد شد، این مرز ها را جدا می کنیم ، آنیلین را جدا کرده و به سراغ بنزیلات سدیم می رویم که ماهیت ترکیب اولیه را عوض کرده ایم و باید بازش گردانیم برای این کار مقداری اسید اضافه می کنیم واکنش بر می گردد و بنزوئیک اسید رسوب می دهد .

آمین های آروماتیک در آب حل نمی شوند ، برای حل کردن آن به محیط اسید HCL اضافه می کنیم ، NH2 با +H حل شده ایجاد می شود ، برای برگشت آنیلین به حالت اولیه ی خودش به محیط -OH اضافه می کنیم
گاهی اوقات محلول نمکی ماهیت ترکیب را تغییر می دهد  Ksp آن را هم در آب افزایش میدهد

روش های استخراج

  مایع - مایع          جامد- مایع

مایع _ مایع

شکل فیزیکی هر دو ماده مایع است ، حلالی هم که استفاده می کنیم مایع است حلالی را انتخاب می کنیم که یکی از مواد مثل آ در آن بیشتر حل شود و ب کمتر و حلال دیگری برعکس باشد اما اگر هر دو ماده ی آ و ب در حلال حل شوند عیبی ندارد می شود روش استخراج را عوض کرد یعنی حلالیت یکی را کم کنیم یعنی تغییر حلالیت دهیم
رزولسینول ها بسیار خورنده هستند و سمی ، در داخل دی اتیل اتر بهتر حل می شود

جامدی بدست می آوریم که ویسکوزیته ی بالا دارد چون نقطه ی ذوب آن پایین است . به محض این که حرارت دید مقداری جامد شده مجددا مایع می شود که ویسکوزیته ی بالا دارد ، در نهایت یک پودری بدست می آید (( پودر هموژن قهوه ای رنگ ))
اگر رنگ متفاوت بود بدین معنی است که مقداری از حلال باقی مانده و باید خوب بهم بزنیم تا خارج شود
طبقه بندی روش های استخراج از نظر تعداد دفعات استخراج

پیوسته و  ناپیوسته
در پیوسته یک بار حجم مشخصی از حلال را بر می داریم و در طول تمامی مراحلاستخراج با همان حجم مشخص کار می کنیم . در ناپیوسته هر بار که می خواهیم عمل استخراج را تکرار کنیم باید یک حجم جدیدی از حلال را بر داریم ،
استخراج پیوسته مقرون به صرفه است
دستگاه وله : استخراج پیوسته درون آن انجام می گیرد ، استخراج از نوع جامد_مایع 
حلال ها

 استون ، متانول ، اتانول، و یا مخلوط آب و استون_آب و متانول و آب و اتانول
از این این مخلوط های حلال ها استفاده می کنند چون دمای جوش آب بالا و دمای جوش بقیه پایین است در اثر حرارت دادن ترکیبات آلی آسیب نبینند .
فشار با نقطه ی جوش رابطه ی مستقیم دارد
خصوصیت حلال های مناسب غیر فعال شیمیایی
1_ به آسانی قابل جدا کردن باشد 2_ با ماده ی آل واکنش شیمیایی ندهد 3_ سمس و آتش گیر نباشد و ارزان باشد 4_ ماده ی ناخالصی تا حد امکان داخل حلال کمتر حل شود
البته اکثر حلال ها سمی و آتش گیر هستند که برای جبران آن ها از مخلوط حلال ها استفاده می کنیم .

ضریب توزیع
وقتی می خواهیم ضریب توضیع آ را را داخل دو حلال 1 و 2 بدست آوریم:

تنها عامل فیزیکی که در ضریب توزیع تاثیر می گذارد دما است : دما بیشتر ضریب توزیع بیشتر

وسایل و مواد مورد نیاز:

اسید بنزوئیک و پارانیتروآنیلین و کلروزم/دکانتور

مراحل آزمایش:

اسید بنزوئیک و پارانیتروآنیلین را با کلروزم مخلوط کرده و درون دکانتور ریختیم.60میلی لیتر

را به آن اضافه کردیم کاملا هم زدیم تا نمک ایجاد شده به فاز آبی برود.بعد اسید بنزوئیک پایین ماند –فاز آلی را به وسیلهHcl سشوآر جدا کرده تا رسوب اسید بنزوئیک  ایجاد شود.و در بالا پارانیتروآنیلین ماند- فاز آبی است که با اضافه کردن 60میلی لیتر

بلور شیشه مانند و درخشان بر روی دیواره ی قیف ایجاد شد.

نکاتی چند در مورد مواد آزمایش :

بنزوئیک اسید:

نام:       Benzoic acid

نام دیگر:   فنیل فرمیک اسید                                             

فرمول مولکولی:    C₇H₆O₂

جرم مولکولی (گرم بر مول):  122.12

نقطه ذوب (درجه سانتیگراد): 122.4

چگالی (گرم بر سانتیمتر مکعب): 1.27

حالت: جامد

رنگ: سفید

pH: 3

روش عمومي تبلور عبارت است از :
●  حل كردن جسم در حلال مناسب به كمك گرما و تهيه محلول سير شده از جسم
●  صاف كردن سريع محلول گرم
●  سرد كردن تدريجي محلول صاف شده به منظور راسب كردن جسم به شكل بلور
●  صاف كردن و شستن بلورها با حلال سرد  و خشك كردن آنها
●  تعيين نقطه ذوب بلور

عوامل تاثیر گذار در حلالیت:
خصوصیات حلال ( قطبی یا غیرقطبی)
 حجم حلال 
 دمای حلال ( حلالیت با افزایش دما افزایش میابد )
انتخاب حلال مناسب نكته اساسي و مهم در عمل تبلورمحسوب مي شود. حلال مناسب حلالي است كه در دماي معمولي جسم را به مقدار جزئي در خود حل كند، ولي در گرما و به ويژه در دماي جوش، اين انحلال به آساني صورت گيرد. عامل ديگر در انتخاب حلال مناسب، توجه به قطبيت آن است كه با توجه به ساختمان ماده مورد نظر انتخاب مي شود. زيرا تركيبات قطبي در حلالهاي قطبي و تركيبات غير قطبي در حلالهاي غير قطبي حل مي شوند.

به هنگام انتخاب حلال مناسب براي تبلور، به نكات زير باید توجه کرد :
●  حلال در دماي معمولي ( دماي آزمايشگاه ) نباید تركيب را حل كند، اما در نقطه جوش خود بايد حداكثر تركيب يا تمام آن را در خود حل كند.
●  نقطه جوش حلال نبايد از نقطه ذوب تركيب مورد نظر بيشتر باشد. زيرا در اين صورت، پيش از اينكه دماي حلال به نقطه جوش آن برسد، جسم در حلال ذوب مي شود. ( در پديده تبلور، جسم بايد در حلال حل شود)
●  حلال و جسم حل شده نبايد با هم واكنش بدهند.
●  تا حد امكان نقطه جوش حلال پايين باشد تا به آساني تبخير شود.

چند نکته در مورد عمل تبلور :
● چنانچه محلول به شدت رنگي و يا ناخالص باشد، گرم كردن را قطع كنيد پس از اينكه محلول، اندكي خنك شد، كمي پودر زغال به آن اضافه كنيد. زغال به دليل دارا بودن سطح فعال زياد مي تواند ناخالص يها و رنگ را به خود جذب كند. سپس مجددا محلول را گرم كنيد.
● برای تسریع در عمل تبلور يك تكه از بلور تركيب را به عنوان هسته اوليه در ظرف بيندازيد اين عمل را بذرافشاني مي نامند.

تبلور مجدد (نوبلور سازی)

در واکنشهای آلی محصولات بندرت به صورت خالص به دست می آیند. وقتی ماده به صورت جامد باشد معمولا آنرا در حلالی حل کرده ومجددا به صورت بلور رسوب میدهند. این عمل را تبلور مجدد می نامند.

ترکیبی که میخواهیم متبلور کنیم را باید در یک حلال یا مخلوطی از حلالهای داغ، محلول بوده ودر حالت سرد همان حلالها نامحلول باشد. عمل تخلیص در صورتی انجام میشود که ناخالصی، یا در حلال سرد محلول باشد و یا در حلال داغ نامحلول باشد. در حالت دوم محلول رابصورت داغ صاف میکنیم تا ناخالصیهای محلول جدا شوند. اگر محلول رنگی باشد و ما بدانیم که جسم مورد نظر بیرنگ است مقدار کمی از زغال رنگبر به محلول سرد اضافه نموده سپس آنرا حرارت داده، بصورت داغ صاف میکنیم. زغال رنگبر، ناخالصیهای رنگی راجذب میکند.

انتخاب محیط تبلور کار ساده ای نیست، رفتار حلالیت ترکیب یا باید شناخته شده باشد و یا باید به طریق تجربی مشخص گردد. مثلا وقتی که تبلور پارا دی بروموبنزن مورد نظر باشد مخلوطی از اتانل و آب به کار میرود. ترکیب هم در اتانول سرد و هم در اتانل داغ محلول است: از اینرو اتانول تنها، برای این کار مفید نیست. از طرف دیگر این ترکیب چه در آبسرد و چه در آب داغ کم محلول است بنابر این آب تنها نیز برای این کار مفید نیست. اما مخلوط مساوی از الکل و آب در حالت داغ حلال خوبی برای جسم است و در حالت سرد حلالیت آن جزئی است از اینرو از مخلوط این دو حلال برای تبلور پارادی بروموبنزن استفاده میشود.

بعضی مواقع عمل تبلور خودبخود صورت نمیگیرد و باید آنرا بر اثر تحریک متبلور نمود. بدین منظور یا جدار داخلی ظرف در سطح محلول را میخراشند و یا ذراتی خالص از همان جسم را در محلول سرد وارد میکنند تا تبلور شروع شود. بسیاری از ترکیبات بر اثر سرد کردن محلول یا سرد کردن به همراه هم زدن به صورت بلور در میآیند. برخی ترکیبات به صورت روغن در آمده چندین ساعت و حتی گاهی چندین روز وقت لازم است تا بلور تشکیل شود.

بطور خلاصه تبلور مجدد به روش انحلال شامل مراحل زیر است:

(1)- انتخاب حلال مناسب

(2)- انحلال جسم مورد تخلیص در نقطه جوش حلال یا نزدیک به آن

(3)- صاف کردن محلول داغ برای جداکردن ناخالصیهای نامحلول

(4)- تبلور از محلولی که درحال سرد شدن است

(5)- جداکردن بلورها از محلولی که در آن شناورهستند

(6)- شستشوی بلورها برای خارج کردن محلولی که به آنها آغشته است

(7)- خشک کردن بلورها

          خالص سازی بنزوئیک اسید از نظر علمی

یک گرم بنزوئیک اسید ناخالص را در ظرف ارلن مایر 50 میلی لیتری تمیزی قرار دهید. حدود 10 میلی لیتر آب به آن اضافه کنید. با چراغ گاز حرارت دهید تا به آرامی به جوش آید. در قسمتهای یک میلی لیتری به اندازه لازم آب اضافه کنید تا دیگر جسم جامدی در محلول جوشان حل نشود.

          اگر محلول رنگین است (توجه داشته باشید که بنزوئیک اسید خالص باید بیرنگ باشد) محلول را کمی سرد کنید (احتیاط: هیچگاه به محلول جوشان زغال رنگبر اضافه نکنید) حدود 1/0 گرم زغال رنگبر اضافه کنید و دوباره مخلوط را همراه با همزدن گرم کنید تا برای چند دقیقه بجوشد. مخلوط داغ را مطابق شکل (1) بصورت داغ صاف کنید. ظرف خالی را با 1 تا 2 میلی لیتر آب داغ بشویید و محلول شستشو را از صافی عبور دهید. در صورتی که محلول صاف شده هنوز رنگی باشد، عمل با زغال رنگبر را تکرار کنید. اگر طی صاف کردن بلور تشکیل شد محلول را دوباره حرارت دهید تا بلورها حل شود سپس ظرف را با شیشه ساعت یا بشر معکوسی بپوشانید و اجازه دهید به آرامی سرد شود تا به دمای اتاق برسد (اگر سریع سرد شود بلورهای ریز ایجاد میشود). سپس ظرف را برای حدود 15 دقیقه در آب یخ قرار دهید.

به کمک صافی مکنده ای (تکه ای از کاغذ صافی را به اندازه کف قیف بوخنر بریده و در ته قیف قرار داده و با کمی حلال خیس کنید تا به کف قیف بوخنر بچسبد دستگاه را ببندید.) بلورها را جمع آوری کنید و توده رسوب روی صافی را با دو قسمت کم آب سرد بشویید.

 بلور ها را بر روی تکه ای کاغذ صافی یا بهتر از آن بر روی شیشه ساعتی، پخش کنید و بگذارید تا در هوا کاملا خشک شود. وزن و نقطه ذوب محصول خالص شده را پس از اینکه کاملا خشک شد اندازه بگیرید. درصد بازده را حساب کنید.

مواد و وسایل مورد نیاز :

  بنزوئیک اسید    آب مقطر  بشر   گیره و پایه    سپایه و توری نسوز   حرارت

مراحل آزمایش :

1 گرم  بنزوئیک اسید تاخالص را درون یک بشر ریختیمم سپس 10 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه کردیم وبشر را بر روی شعله یا هیتر قرار گذاشتیم و حرارت میدهیم ،حین حرارت دادن محلول را با همزن هم میزنیم تا تمام مواد در آب حل شوند.وقتی که مطمئن شدیم تمام ماده حل شده است حرارت را قطع کردیم و گذاشتیم سرد شود.

نتیجه آزمایش:

بلور شیشه مانند و درخشان تشکیل شد.

تئوری آزمایش:

مقدمه: روشهای مختلفی برای جداسازی مواد اجزای سازنده یک محلول وجود دارد که یکی از این روشها فرایند تقطیر می‌باشد در روش تقطیر جداکردن اجزاء یک مخلوط ، از روی اختلاف نقطه جوش آنها انجام می‌گیرد. تقطیر ، در واقع ، جداسازی فیزیکی برشهای نفتی است که اساس آن ، اختلاف در نقطه جوش هیدروکربنهای مختلف است. هر چه هیدروکربن سنگینتر باشد، نقطه جوش آن زیاد است و هر چه هیدروکربن سبکتر باشد، زودتر خارج می‌شود.

تقطیر: تبخير يك مايع و تراكم بخارات دراثر سرما (ميعان) و جمع آوري قطرات در ظرف ديگر را تقطير مي گويند كه عادي ترين روش براي خالص نمودن مايعات مي باشد. براي تخليص مايعات چهار نوع تقطير در آزمايشگاه مورد استفاده قرار مي گيرد:

1-            تقطير ساده

2-            تقطير در فشار كم

3-            تقطير به وسيله ي بخار آب

4-            تقطير جزء به جزء 

1- تقطير ساده

وجودناخالصي هاي غيرفرّاردرمايع سبب كاهش فشاربخارآن مي شود ، زيرا وجودجزء غير فرار به مقدار زياد ،غلظت جزء اصلي فرّار را پايين مي آورد وقابليت تبخير مايع كم مي شوداماپس از تقطير در باقيمانده ي تقطيرباقي مي ماند ومايع به صورت خالص تقطير مي شود.

   به طوركلي ، بخاراتي كه در سطح مايع است بيشتر از جسم فرّار تشكيل شده است و كمتر از جسم غير فرّار است. ( قانون رائولت و دالتون )   چنانچه مخلوطي از دو يا چند مايع داشته باشيم و دماي جوش آن ها به حد كافي با هم تفاوت داشته باشد، جدا كردن آن ها از طريق تقطير ساده امكان پذيراست. ابتدا مايعي كه نقطه ي جوش كمتري دارد تقطير مي شود و سپس اجزاء ديگر مخلوط ،به تناسب افزايش دماي جوششان تقطير مي شوند و بدين ترتيب مي توان آن ها را از يك ديگر جدا نمود. مي توان گفت اختلاف نقطه ي جوش بايد بيش از 80 درجه ي سانتيگراد باشد.  براي تقطير ساده ، بالن تقطير (فلاسك) ، مُبرد ، رابط ، دماسنج ، و بالن دريافت كننده لازم است. نحوه آماده كردن دستگاه مطابق شكل زير است در تقطير يك مايع خالص ،درجه حرارت دهانه ي خروجي رابط بادرجه حرارت مايع جوشان بالن تقطير ، چنانچه بالن زياده ازحد گرم نشود،يكسان است. چنانچه فقط اندازه گيري دماي جوش ،مورد نظر باشد، مي توان بدون مُبرد مقدار دماي جوش را تعيين كرد.

Pa=Pa Xa & Pb=Pb Xb→Pa/Pb=Pa/Pb xXa/1-Xa→Ya/1-Ya=Pa/Pb x Xa/1-Xa→Y/1-Y=a X/1-X

2-- تقطير  در فشار كم

     در بسياري از موارد ، دماي جوش در فشار معمولي زياد است و ممكن است تركيب مورد نظر در دمايي پايين تر از دماي جوش خود يا دردماي جوش تجزيه يااكسيد شود و يا نوآرايي در آن صورت پذيرد ، در چنين مواردي ، جسم را درفشار كمتر از فشار جوّ تقطير مي كنيم. معمولاً تركيباتي كه دماي جوش آن ها از حدود180درجه ي سانتيگراد بيشتر است را با روش تقطيردر فشار كم تقطير مي كنند. براي مثال ، نقطه ي جوش يك تركيب كه درفشار 760 ميليمترجيوه 200 درجه ي  سانتيگراد است،در فشار 20 ميليمتر جيوه حدود 90 درجه ي سانتيگراد است.

   براي كم كردن فشار ،معمولاً از خرطوم آبي يا پمپ روغني استفاده مي شود. مقدار كاهش فشار در هر يك ازاين دو وسيله به شرايط آن ها و دستگاه تقطير بستگي دارد.                                                                                                                                                                

3- تقطير به وسيله ي بخار آب

   مي دانيم كه مجموع دو مايع مخلوط نشدني ، از هر كدام از دو مايع به طور جداگانه ،در درجه حرارت پايين تري مي جوشد. چنانچه يكي از دو مايع آب باشد و عمل تقطير انجام شود، آن را  تقطير همراه با بخار آب مي گويند. بنا براين، مايع مورد نظردرپايين 100 درجه ي سانتيگراد تقطير مي شود. بدين ترتيب ،يك تركيب كه در آب بسيار نامحلول است ، در مخلوط با آب تقطير مي شود ومواردي را كه دماي جوششان خيلي بالاتر از 100 درجه ي سانتيگراد است را به راحتي مي توان تقطير كرد. بنا براين اگر ماده ي مورد نظر در حرارت هاي بالا ناپايدار باشد و يا تجزيه شود،با اين روش تقطير مي شوند.اين روش را مي توان در مورد جدا سازي تركيبات طبيعي از بافت ها و سلولها و گرفتن روغن هاي اسانس گياهان و به طور كلي مواردي كه با آب پيوند هيدروژني تشكيل مي دهند، به كار برد. همچنين براي جدا كردن محصول يك واكنش در مخلوط قير مانند تقطير با بخار آب روش مناسبي است. بديهي است كه از اين روش براي موادي كه در اثر تماس زياد با بخار آب تجزيه مي شوند يا واكنش مي دهند مناسب نمي باشد.

4- تقطير جزء به جزء

      چنانچه تفاوت دماي جوش اجزاء موجود در مخلوط زياد نباشد، از طريق تقطير ساده نمي توان اجزاء مخلوط را جدا نمود. در اين گونه موارد، از روش تقطير جزء به جزء استفاده مي شود. در اين روش، يك ستون تقطير بين بالون تقطير ومُبرد قرار مي گيرد ودرطول ستون چندين بار عمل تبديل بخار به مايع انجام مي شود و در هر بار، بخار از تركيبي كه داراي دماي جوش كمتري است،غني مي گردد. وقتي بخار به انتهاي ستون مي رسد و وارد مُبرد مي شود، فقط بخار يك جزء (دماي جوش پايين)است كه در اثر ميعان به قطرات مايع تبديل مي گردد. طول و نوع ستون و در بعضي موارد مواد پركننده ي داخل ستون با در نظر گرفتن اجزاء مخلوط انتخاب مي شود. براي جدا كردن مخلوطي كه اجزاء آن حدود 20- 15 درجه ي سانتيگراد تفاوت دماي جوش دارند، معمولاًاز ستون ويگرواستفاده مي شود. اين ستون داراي برجستگي هاي خار مانند شيشه اي در سطح داخلي است كه بر اثر سطح تماس زياد سبب بيشتر شدن مراحل بخار- ميعان مي شود.

  وسایل آزمایش:

پایه-گیره-بالون-شلنگ-استوانه-خرطومی-بشر کوچک-شعله

مواد مورد نیاز:

آب-ماده مجهول

مراحل آزمایش:

2 عدد پایه بر میداریم. یک بالن تقطیر برداشته و مقداری ماده مجهول در آن ریختیم و چند عدد سنگ جوش((همانطور که میدانیم سنگ جوش ماده ای شیشه ای است که از آن به منظور پخش یکنواخت گرما دریک محلول یا مایع در حال گرم شدن(در معرض حرارت) استفاده میکنیم.که باعث تاخیر در جوش میشود و از تبخیر ناگهانی و بالا آمدن توده ای بخارات و پرت شدن درون مبرد جلوگیری میکند))در آن انداختیم ، وبعد رابط شیشه ای را روی بالن قرار دادیم و دماسنج را وارد رابط شیشه ای کردیم. بالن را از قسمت بالا به گیره متصل میکنیم. و بعد استوانه را به طور مورب به رابط شیشه ای متصل کردیم و به گیره متصل نمودیم و بعد خرطومی را به انتهای استوانه وصل کردیم سپس یک بشر کوچک زیر خرطومی گذاشتیم(درون بشر ماده فرارتر وارد میشود).شلنگ را به آب وصل کردیم و به مجرای موجود در بالای استوانه متصل کردیم.شلنگ دیگر را به مجرای پایین استوانه متصل کردیم و به درون سینک گذاشتیم.شعله را زیر بالون قرار دادیم.آب را باز کردیم تا وارد استوانه شود.بعد شعله را روشن نمودیم تا ماده مجهول بجوشد.بعد از گرفتن حرارت کم کم ماده ای که فراریت بیشتری دارد تقطیر شده و به بشر منتقل شد.

وقتی به دمای ثابت رسید میتوان نوع ماده را فهمید.

*دمای ماده ای که فراریتش بیشتر است,بعد از ثابت شدن دما,قطرات آب کم میشود.

نتایج آزمایش:

اولین قطره ماده فرارتر در 67درجه وارد بشر شد.

دما در 76 درجه ثابت شد=دمای ماده ی فرارتر(اتانول)

تئوری آزمایش:

نقطه جوش: وقتی فشار بخار مایعی با فشار محیط برابرشد یا به تعادل رسید مایع خواهد جوشید و دما، دمای جوش مایع خواهد بود .
وقتی فشار بخار مایع با فشار وارد بر سطح مایع یکی شودمایع شروع به جوشیدن می کند جایی که فاز مایع و فاز بخار در تعادل باشند آن جا نقطه ی جوش مایع خواهد بود.

عوامل موثر بر نقطه جوش:

یکسری عوامل می تواند در رند افزایش یا کاهش نقطه جوش یک ماده خالص تاثیرگذار باشد این موارد شامل ناخالصی های فرار وغیرفرار –داشتن پیوندهای شیمیایی محکم و تغییرات فشار محیط است.هرچه پیوندهای بین مولکولی در مایع قوی تر باشد نقطه جوش بالاتر است. همچنین فشار با نقطه جوش رابطه مستقیم دارد.گروه های عاملی هم میتوانند جز گروههای الکترون دهنده باشند یاالکترون گیرنده که برحسب نوع مایع میتواند انرا پایدار کند و نقطه جوش را افزایش دهد یا بالعکس.

میزان نقطه ی جوش و نقطه ی ذوب به نیروهای بین مولکولی مربوط می شود. هر چه این نیروها قویتر باشند، مولکولها با استحکام بیشتری در کنار یکدیگر نگه داشته می شوند و درنتیجه سست کردن آنها برای ذوب شدن ماده یا از بین بردن کامل آنها برای جوشاندن و تبخیر ماده ، دشوارتر می شود و نیاز به صرف انرژی بیشتری می باشد.

روش های تعیین نقطه جوش:

2روش وجود دارد.استفاده از این دو روش به مقدار ماده موجود بستگی دارد.چنانچه مایع به مقدار کافی یا زیاد در دسترس باشد نقطه جوش آن را می توان به روش تقطیر ساده و به کمک دماسنج تععین کرد.در صورتیکه مقدار مایع کم باشد از روش نقطه جوش میکرو استفاده می شود. در تعين نقطه جوش به روش میكرو مشكلاتي به شرح زير پيش مي آيد:
چون مقدار مايع اندك است، در صورت افزايش ناگهاني گرما احتمال بخار شدن آن وجود دارد، و يا اينكه ممكن است نقطه جوش به دست آمده بيشتر از مقدار واقعي باشد.
اگر گرم كردن كافي نباشد، در نزديكي نقطه جوش، در صورت گرما، ممكن است مايع از لوله آزمايش، وارد لوله مويين شود، زيرا در اين لحظه فشار بخار مايع پايينتر از فشار هواست. نقطه جوش به دست آمده در اين روش به علت تجربه ناكافي آزمايش كننده و خطاي چشم، تقريبي، و غالبا كمتر از مقدار واقعي است.

وسایل آزمایش:
چراغ کوچک بونزن/ لوله مویین/ چسب/ دماسنج / لوله تیل/ لوله آزمایش
مواد مورد نیاز:
آب، اتانول
مراحل آزمایش:
در اين روش از لوله آزمايش استفاده مي شود. مقدار5/0میلی لیتر اتانول را به وسيله پي پت  به درون لوله آزمايش ریختیم.
سپس لوله موييني را كه يك انتهاي آن (سمت رنگی) مسدود شده است به طور واژگون از انتهاي باز آن به درون لوله انداختیم.
بعد اين لوله را به وسيله چسب به دماسنج متصل کردیم. همانگونه كه در تعيين نقطه ذوب عمل كرديم. انتهاي لوله و دماسنج بايد در يك سطح باشند
اين مجموعه را در آب قرار دادیم و به آرامي گرم کردیم.
پس از مدتي گرم كردن، جريان منظم و يكنواختي از حباب هوا از انتهاي لوله مويين خارج مي شود.
در اين مرحله گرما را قطع مي كنيم و ملاحظه مي شود كه جريان حباب هوا قطع مي شود و سپس مقداري از مايع وارد لوله مويين مي شود. در اين لحظه عدد دماسنج را مي خوانيم و ثبت مي كنيم. اين دما، نقطه جوش مايع است.

محاسبات و نتایج:

دمای به دست آمده برای اولین حباب های  خارج شده:80 درجه

دمای به دست آمده برای آخرین حباب خارج شده:78 درجه

سوال:

چرا در مواردی که امکان تشکیل پیوند هیدروژنی درون مولکولی وجود دارد نقطه جوش کاهش می یابد؟

زیرا وقتی اتم های هیدروژن ، اکسیژن و فلوئور و نیتروژن درون یک مولکول باهم ایجاد پیوند هیدروژنی کنند دیگر سایت و جایگاهی باقی نمی ماند که با مولکول های دیگرمجاور پیوند هیدروژنی تشکیل دهند در نتیجه مولکول ها از هم فاصله می گیرند و نقطه جوش کاهش می یابد.

کاربرد نقطه ذوب:

1-شناسایی ترکیبات آلی 2-خالص بودن یا ناخالص بودن یک ترکیب آلی

نقطه ذوب:به یک جامدی دمایی دهیم تا از یک بلور منظم به یک ساختمان نامنظم تبدیل شود.

دمای ذوب:دمایی است که فاز جامد و مایع با هم در تعادل باشند.و در آن درجه حرارت فشار بخار جامد با فشار بخار مایع برابر است.

عوامل تاثیر گذار بر نقطه ذوب:

1-افزایش فشار اسمزی  2-شکل مولکولی   3-درجه تجمع,نقطه ذوب با درجه تجمع یک ترکیب افزایش می یابد.

4-ناخالصی ها,باعث کاهش نقطه ذوب می شوند.   5-اندازه نمونه   6-سرعت گرم کردن

*اگر دو ماده دارای نقطه ذوب یکسان باشند و مخلوط این دو ماده هم دارای همان نقطه ذوب باشند می توانیم نتیجه بگیریم که این دو ماده یکی هستند پس این مورد می تواند راهی برای شناسایی یک جسم جامد مجهول باشد.

مواد و وسایل مورد نیاز:

لوله ی موئین-اسید بنزئیک-دماسنج-پارافین-شعله

روش کار:

یک لوله ی مویین تمیز برداشته و بوسیله ی شعله یک طرف آنرا مسدود کنید . سپس چند بار نوک باز لوله مویین را آهسته به داخل جسم جامد بزنید ،  با برگرداندن لوله و با زدن سریع انتهای بسته لوله بر روی یک سطح محکم میتوان جسم جامد را به طرف انتهای بسته لوله هدایت کرد . جسم باید در انتهای بسته لوله کاملا متراکم شود . بهترین راه انجام این کار آن است که در خاتمه لوله مویین را از درون یک لوله پاسکال بر روی سطح محکمی رها کنید . نمونه باید به اندازه ای باشد که پس از عمل تراکم لوله مویین را تا عمق ٣ - ٢ میلی متر پر کند . این مقدار نباید بیشتر باشد . لوله مویین را به وسیله ی کمی نوار چسب به دماسنج متصل کنید . خود نمونه باید در مجاورت حباب گرماسنج باشد و چسب شیشه ای در بالا ترین جا تا از سطح مایع داغ دور باشد . سپس دماسنج را به گیره متصل کرده و داخل حمام کنید .  با استفاده از حرارت یک چراغ کوچک بونزن به آرامی درجه حرارت مایعی را که باید گرم می شود)  مایع حمام معمولا از پارافین ، گلی کول ، گلیسیرین ، اسید سولفوریک غلیظ که نقطه جوش بالایی دارند استفاده) درجه ای را که ابتدا عمل ذوب مشاهده میشود و همچنین درجه ای را که در آن آخرین قسمت جامد ذوب میشود را یادداشت می کنیم.

                                                                                                           محاسبات و نتایج:

اولین قطره ای که بخار شد= 119-118              نقطه ذوب:122- 120

سوال:

چرا ناخالصی ها باعث کاهش نقطه ذوب می شوند؟

اختلاف دمای نقطه ی ابتدایی و انتهایی زیاد شده نقطه ذوب کاهش می یابد.

• گزارش کار جانور شناسی
• آزمایشگاه شیمی آلی
• ایمیل و روش استفاده از آن
• آزمایشگاه زیست سلولی
• آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی
• آزمایشگاه شیمی عمومی 2
• آزمایشگاه میکروبیولوژی1
• آزمایشگاه میکروبیولوژی 2
• آزمایشگاه ژنتیک 1
• آزمایشگاه بیوشیمی 2
• آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری
• میکروبیولوژِی
• قارچ شناسی
• دانستنی ها
• آزمایشگاه ژنتیک 2
• آزمایشگاه پروتوزئولوژی
• آزمایشگاه میکروبیولوژی محیطی

• گزارش کار جانور شناسی (1)

• قالب وبلاگ

• تمزها
• گلوله
• اسپری پنچرگیری لاستیک
• دانلود فیلم
• گلچین سایت ها